Name: analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models
Uploaded: 2023-01-27T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Heart, Lung, and Blood Institute van de National Institutes of Health (NIH) (1R01HL160740 en 5 T32GM132054-04) en de Florida Heart Research Foundation. We willen Kassandra Gomez bedanken voor haar hulp bij het synthetiseren en in beeld brengen van de hydrogels.

Het in vivo werk werd goedgekeurd en gecontroleerd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Florida International University en voldeed aan de huidige richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH). Voor dit protocol verschilt de procedure niet afhankelijk van de stam, het gewicht, de leeftijd en het geslacht van de muis. Het type verkalking dat wordt bestudeerd, diëten en behandelingen kunnen de duur van het onderzoek en het gewicht van de gebruikte muis veranderen en kunnen a...

<ol>
	<li>Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+mediators+of+cardiovascular+calcification.">Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).</li><li>Ho, C. Y., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+arterial+calcification:+an+overlooked+player+in+peripheral+arterial+disease.">Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).</li><li>Marinelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+arterial+media+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease.</a> Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).</li><li>Moe, S. M., Chen, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).</li><li>Mir, B., Goettsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+delivery+vehicles+of+specific+cellular+cargo.">Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo.</a> Cells. 9 (7), 1601 (2020).</li><li>Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification:+Current+controversies+and+novel+concepts.">Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).</li><li>New, S. E., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+vesicles+in+de+novo+mineralization:+An+additional+novel+mechanism+of+cardiovascular+calcification.">Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).</li><li>Aikawa, E., Hutcheson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , (2020).</li><li>Johnson, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-407-induced+murine+model+of+dose-controlled+hyperlipidemia+and+atherosclerosis:+A+review+of+findings+to+date.">The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).</li><li>Shobeiri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+animal+models+of+CKD:+A+review.">Vascular calcification in animal models of CKD: A review.</a> American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).</li><li>El-Abbadi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+feeding+induces+arterial+medial+calcification+in+uremic+mice:+role+of+serum+phosphorus,+fibroblast+growth+factor-23,+and+osteopontin.">Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin.</a> Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).</li><li>Veseli, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li><li>Chen, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase+2+accelerates+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease.</a> American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).</li><li>Wu, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+the+nucleational+core+of+matrix+vesicles.">Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).</li><li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques.">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).</li></ol>

Bij het uitvoeren van het protocol is het belangrijk om de kritieke stappen voor het verkrijgen van succesvolle resultaten te noteren. Tijdens de isolatie van de murine aorta is het van vitaal belang dat de perfusie goed wordt uitgevoerd. Bij het injecteren van de PBS moet ervoor worden gezorgd dat de rechterkamer niet wordt doorboord. Dit zou ervoor zorgen dat de vloeistof rechtstreeks uit de ventrikel lekt en niet door de longen circuleert, waardoor bloed in de aorta achterblijft. Zodra de perfusie goed is uitgevoerd e...

Verkalking is de belangrijkste voorspeller van sterfte en morbiditeit van hart- en vaatziekten1. Verkalking verandert de slagaderwandmechanica door de opbouw van calcium- en fosfaatmineralen2. Bij atherosclerose kan verkalking lokale stress verergeren en resulteren in plaqueruptuur, wat de belangrijkste oorzaak is van hartaanvallen. Mediale verkalking - vaak als gevolg van chronische nierziekte - is wijdverspreider en leidt tot significante arteriële verstijving, disfunctie en cardiale overbelasting 2,3. Momenteel zijn er geen therapeutische opties voor de behandeling of preventie van vasculaire calcificatie.
Vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) nemen een osteoblastachtig fenotype aan en geven verkalkende extracellulaire blaasjes (EV's) af die ontluikende mineralen nucleeren, waardoor verkalking wordt aangedreven 4,5,6. Dit proces lijkt op de fysiologische mineralisatie van osteoblasten in bot7. Hoewel het eindpunt van mineralisatie vergelijkbaar is in de vaatwand- en botmatrix, verschillen de mechanismen waardoor de verkalkende EV's ontstaan in de twee weefsels8. Er zijn veel soorten modellen die worden gebruikt om vasculaire calcificatie te bestuderen. In vitro bootsen celkweekmodellen de osteogene overgang van VSMC's en de daaropvolgende mineraalvorming na met gespecialiseerde media.
Bij het bestuderen van in vivo verkalking hangt het gebruikte model af van het type verkalking dat wordt bestudeerd. Hyperlipidemische muismodellen worden vaak gebruikt om atherosclerotische verkalking te bestuderen, die meer focaal lijkt binnen lipidenrijke plaques9. Mediale verkalking is daarentegen wijdverspreider in de vasculatuur en wordt vaak bestudeerd met behulp van chronische nierziektemodellen die een adeninerijk dieetregime gebruiken om nierfalen te induceren of chirurgische technieken om aanzienlijke delen van de nieren te verwijderen10,11. Agressieve modellen van vasculaire calcificatie hebben een combinatie van zowel hyperlipidemische als chronische nierziektemodellengebruikt 12. Dit protocol biedt een methode voor het beoordelen van vasculaire calcificatie in muriene aortas voor zowel mediale als atherosclerotische calcificatie, het extraheren van EV's uit de aortawand en het observeren van het mineralisatiepotentieel in de EV's verkregen uit in vitro celkweekmodellen. Toekomstige studies kunnen deze procedures gebruiken in mechanistische analyses van vasculaire calcificatie en om potentiële therapeutische interventies te beoordelen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155409PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 inch Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, High Concentraion, Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-8254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dish</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-90-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pan and Wax</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>DSPA01-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>DLx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)&#160;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B11229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680EX</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A4782602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multimode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 96-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>TPIN02-PK/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models

Hart- en vaatziekten zijn de belangrijkste doodsoorzaak in de wereld en vasculaire verkalking is de belangrijkste voorspeller van cardiovasculaire gebeurtenissen; Er zijn momenteel echter geen behandelings- of therapeutische opties voor vasculaire calcificatie. Verkalking begint in gespecialiseerde extracellulaire blaasjes (EV's), die dienen als kernhaarden door calcium- en fosfaationen te aggregeren. Dit protocol beschrijft methoden voor het verkrijgen en beoordelen van verkalking in muriene aortas en het analyseren van de bijbehorende geëxtraheerde EV's. Eerst wordt grove dissectie van de muis uitgevoerd om relevante organen te verzamelen, zoals de nieren, lever en longen. Vervolgens wordt de muriene aorta geïsoleerd en weggesneden van de aortawortel naar de dijbeenslagader. Twee tot drie aorta's worden vervolgens samengevoegd en geïncubeerd in een spijsverteringsoplossing voordat ze ultracentrifugatie ondergaan om de EV's van belang te isoleren. Vervolgens wordt het mineralisatiepotentieel van de EV's bepaald door incubatie in een fosfaatrijke oplossing en het meten van de lichtabsorptie bij een golflengte van 340 nm. Ten slotte worden collageenhydrogels gebruikt om de verkalkte minerale vorming en rijping geproduceerd door de EV's in vitro te observeren.

Zodra de aorta's zijn geëxtraheerd, toont beeldvorming met behulp van een nabij-infrarode optische scanner een visuele weergave van de aorta en de vasculaire verkalking (figuur 1). De pixelintensiteitswaarden in de gescande fluorescerende afbeelding vertegenwoordigen de verdeling van verkalking en worden hier weergegeven met behulp van een gekleurde heatmap. Kwantificeringsmethoden omvatten het identificeren van een positieve drempel en het rapporteren van het procentuele gebied van de aort...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models at JoVE.com

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Dit artikel presenteert de methodologie voor het verkrijgen en beoordelen van vasculaire calcificatie door het isoleren van muriene aorta's gevolgd door het extraheren van verkalkte extracellulaire blaasjes om het mineralisatiepotentieel te observeren.

Analyse van extracellulaire vesicle-gemedieerde vasculaire calcificatie met behulp van in vitro en in vivo modellen

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Dit protocol biedt een methode die kan worden gebruikt om te helpen bij het beoordelen en in de toekomst helpen bij het ontwikkelen van behandelingen voor vasculaire calcificatie, de belangrijkste voorspeller van hart- en vaatziekten. Het vermogen om EV's te isoleren stelt ons in staat om de mechanismen die leiden tot vasculaire verkalking en de fenotypische verandering van vasculaire gladde spiercellen verder te bestuderen. Deze techniek geeft inzicht in vroege moleculaire mechanismen van vasculaire gladde spiercel-gemedieerde verkalking.Door dit te begrijpen, kunnen therapeutische opties worden bestudeerd voor het begrepen mechanisme. Alle EV's van belang kunnen met behulp van deze methode worden bestudeerd. Het is niet exclusief voor vasculaire gladde spiercellen, osteoblasten of vasculaire calcificatie.Nadat u de muis hebt geëuthanaseerd, tilt u de huid op met een pincet en maakt u een incisie langs de middellijn. Verwijder overtollige huid of vet. Verwijder vervolgens de voortplantingsorganen, blaas en vet buiten de middellijn.Verplaats vervolgens de gastro-intestinale organen naar de rechterkant en volg de darmen in de middellijn. Eenmaal gevonden, til de middellijn op en snijd het maagdarmkanaal weg tot aan de maag. Snijd de nieren weg door ze weg te tillen van de middellijn.Snijd zo dicht mogelijk bij de nier. Verwijder de lever door de lobben op te tillen en weg te snijden van de middellijn. Perfuseer vervolgens het hart en de aorta door koude PBS in de rechterkamer te injecteren met behulp van een spuit van 10 milliliter.Wacht tot de longen zijn opgeblazen en wit worden. Verwijder de longen en eventuele overtollige middenrif of ribbenkast. Om het bot te verwijderen, opent u een schaar breed en plaatst u deze op het onderste deel van de muis boven de staart.Snijd naar beneden, til de wervelkolom van de huid en verwijder het vet van de zijkanten van de middellijn. Zodra de huid is losgemaakt, snijdt u de wervelkolom en intacte organen weg door recht boven het hart te snijden. Plaats de wervelkolom en intacte organen in een bekerglas PBS in de ijsemmer als u ze naar een stereoscoop transporteert.Nadat u de wervelkolom en organen in de ontleedschaal hebt verplaatst, vult u deze met ijskoude PBS en pint u de wervelkolom en ribbenkast vast met naalden. Til onder de dissectiemicroscoop het hart voorzichtig op met een pincet en begin met snijden boven de wervelkolom en onder de aorta. Ga hiermee door totdat de onderkant van de wervelkolom is bereikt.Verwijder de wervelkolom uit de ontleedschaal en pin het hart en eventuele vreemde vetten of spieren vast. Beginnend vanuit het gebied direct onder het hart, identificeer de slokdarm, vena cava en aorta. Verwijder de slokdarm en vena cava om een duidelijk gezichtsveld van de aorta te hebben.Gebruik de microdissectietang en schaar om het vetweefsel op te tillen en zo dicht mogelijk bij de aorta te knippen. Ga hiermee door langs de mediale lijn totdat alle aorta en de dijbeenslagaders blootliggen. Verwijder in het hart al het vetweefsel dat de drie takken bij de aortaboog blootlegt.Verwijder de aortawortel uit de linker ventrikel door de microdissectieschaar in de linker ventrikel in te brengen en de spier rond de aorta door te snijden. Zodra de aorta is geïsoleerd en gereinigd, beeldt u de aorta af met behulp van een nabij-infraroodscanner om vasculaire verkalking te visualiseren. Kwantificeer met behulp van het aangepaste MATLAB-script het totale signaal van de calciumtracer genormaliseerd naar het totale gescande aortagebied.Leid het MATLAB naar de locatie van de TIF-bestanden van de nabij-infraroodscan van de aorta's, open de afzonderlijke bestanden en extraheer de pixelintensiteitswaarden uit de TIF-bestanden. Selecteer de aorta met de grootste verkalking als het schaalmaximum op de afbeelding met de kleurtoewijzing. Wanneer de opdracht Hoeveel exemplaren zijn er in de afbeelding in het venster verschijnt, voert u het aantal aorta's in de huidige afbeelding in en selecteert u elke aorta één voor één.Zodra een aorta is geselecteerd, maakt MATLAB binaire afbeeldingen met een masker van het totale gebied en het verkalkte gebied van de aorta. De waarden van deze gemaskeerde beelden worden vervolgens gebruikt om het totale verkalkte gebied, de totale oppervlakte van de aorta, het percentage positieve verkalkingsgebieden en de gemiddelde intensiteit van het verkalkte gebied te bepalen. Onmiddellijk na het scannen van de aorta's, pool twee tot drie aorta's om een voldoende eiwitconcentratie te verkrijgen.Incubeer twee tot drie gepoolde aorta's in 1,5 milliliter spijsverteringsoplossing gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Verzamel de oplossing en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 1.000 g om celresten te verwijderen. Om vervolgens de microvesicles te verwijderen, centrifugeert u het supernatant opnieuw gedurende 30 minuten bij 33.000 g.Verzamel en beoordeel het supernatant op verkalkingspotentieel. Na het verwijderen van het celafval uit het geconditioneerde verzamelde medium door centrifugatie, draait u het verzamelde supernatant gedurende 30 minuten op 33.000 g. Verzamel het supernatant en breng het over in een nieuwe buis.Voeg vervolgens 1% van 300 millimolair natriumdiwaterstoffosfaat toe aan de extracellulaire blaasjesmonsters en meng de oplossing door pipetteren. Breng 200 microliter van de mengseloplossing over in een plaat met 96 putten en incubeer de plaat met 96 putten in de microplaatlezer bij 37 graden Celsius. Stel de plaatlezer in om de absorptie op een golflengte van 340 nanometer elke minuut op te nemen.Pipetteer 300 microliter van de collageenoplossing in elke put van een glas met acht putjes en incubeer gedurende 72 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Voeg na de incubatie 300 microliter DMEM toe als controle in de putten. Voeg 300 microliter van de eerder verzamelde extracellulaire blaasjesmediummonsters toe aan de resterende putten en incubeer gedurende zes dagen, zoals eerder aangetoond.Op de 10e dag, pipetteer 2,5 microliter van het OsteoSense- en DMEM-mengsel in elk putje en incubeer gedurende 24 uur. Aan het einde van de incubatie, beeld de hydrogels met filters voor OsteoSense fluorescentie door de onderkant van een afdekglaskamer met behulp van een omgekeerde microscoop, of vanaf de bovenkant met een lange werkafstandsobjectief. Beoordeel het aantal verkalkingen en de verkalkingsgrootte en de verzamelde beelden met behulp van de deeltjesanalyse-opties die beschikbaar zijn in ImageJ.Navigeer vervolgens naar Afbeelding, selecteer Aanpassen en klik op Drempel om de afbeeldingen te binariseren, zodat alleen het OsteoSense-signaal wit lijkt. Gebruik vervolgens de opdracht Analyseren en klik op Deeltjes analyseren om informatie op te halen voor elke verkalking in de afbeelding. Gebruik dezelfde drempelparameters voor consistentie voor elke geanalyseerde afbeelding.Nabij-infrarood optische scannerbeelden van de ontlede aorta's toonden een hoger OsteoSense-signaal in de aorta van een muis met chronische nierziekte dan de twee aorta's van controlemuizen. Het geconditioneerde medium verkregen uit vasculaire gladde spiercellen gekweekt in een pro-calcific medium vertoonde een hogere absorptie bij 340 nanometer dan het controlemedium. De absorptietoename trad 1,5 keer sneller op in het pro-calcific monster in vergelijking met een controlemonster.Het geconditioneerde medium uit cellen gekweekt in pro-calcific omstandigheden bevatte minerale afzettingen. Bij het micro-ontleden van de aorta is het belangrijk om het vet rond de aorta zorgvuldig te snijden. Je wilt zoveel mogelijk van de aorta analyseren, maar dit kan behoorlijk vervelend zijn.Zodra EV's zijn geïsoleerd, kunnen aanvullende tests, zoals een alkalische fosfatase-activiteitstest of immunolichaam, worden voltooid. Deze tests zouden verder de mechanismen en eiwitten aantonen die aanwezig zijn in EV's.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analyse van de Schwann-astrocyte Interacties gebruik In Vitro Testen

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo en in vitro studies van Adapter-clathrine Interactie

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualisatie van MG53-gemedieerde celmembraan Reparatie gebruik In vivo En In vitro Systemen

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Muis Sperma Cryopreservatie en herstel met behulp van de I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro Synthese van gemodificeerde mRNA voor inductie van eiwitexpressie in menselijke cellen

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Meten van de stijfheid van<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorta&#39;s met behulp van Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Micron-schaal fenotypering technieken van maïs vaatbundels gebaseerd op de X-ray Microcomputed tomografie

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Microbiota-analyse met behulp van twee-stap PCR en de volgende generatie 16S rRNA Gensequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In vitro Analyse van E3 Ubiquitine Ligase Functie

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...