Name: analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models
Uploaded: 2023-01-27T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions du National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health (NIH) (1R01HL160740 et 5 T32GM132054-04) et de la Florida Heart Research Foundation. Nous tenons à remercier Kassandra Gomez pour son aide dans la synthèse et l’imagerie des hydrogels.

Le travail in vivo a été approuvé et supervisé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Florida International University et conforme aux directives actuelles des National Institutes of Health (NIH). Pour ce protocole, la procédure ne diffère pas en fonction de la souche, du poids, de l’âge et du sexe de la souris. Le type de calcification étudié, les régimes alimentaires et les traitements peuvent modifier la durée de l’étude et le poids de la souris util...

<ol>
	<li>Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+mediators+of+cardiovascular+calcification.">Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).</li><li>Ho, C. Y., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+arterial+calcification:+an+overlooked+player+in+peripheral+arterial+disease.">Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).</li><li>Marinelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+arterial+media+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease.</a> Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).</li><li>Moe, S. M., Chen, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).</li><li>Mir, B., Goettsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+delivery+vehicles+of+specific+cellular+cargo.">Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo.</a> Cells. 9 (7), 1601 (2020).</li><li>Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification:+Current+controversies+and+novel+concepts.">Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).</li><li>New, S. E., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+vesicles+in+de+novo+mineralization:+An+additional+novel+mechanism+of+cardiovascular+calcification.">Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).</li><li>Aikawa, E., Hutcheson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , (2020).</li><li>Johnson, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-407-induced+murine+model+of+dose-controlled+hyperlipidemia+and+atherosclerosis:+A+review+of+findings+to+date.">The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).</li><li>Shobeiri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+animal+models+of+CKD:+A+review.">Vascular calcification in animal models of CKD: A review.</a> American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).</li><li>El-Abbadi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+feeding+induces+arterial+medial+calcification+in+uremic+mice:+role+of+serum+phosphorus,+fibroblast+growth+factor-23,+and+osteopontin.">Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin.</a> Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).</li><li>Veseli, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li><li>Chen, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase+2+accelerates+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease.</a> American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).</li><li>Wu, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+the+nucleational+core+of+matrix+vesicles.">Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).</li><li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques.">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).</li></ol>

Lors de l’exécution du protocole, il est important de noter les étapes critiques pour obtenir des résultats positifs. Lors de l’isolement de l’aorte murine, il est essentiel que la perfusion soit effectuée correctement. Lors de l’injection du PBS, il faut veiller à ne pas percer le ventricule droit. Cela provoquerait une fuite du liquide directement hors du ventricule et ne parviendrait pas à circuler dans les poumons, laissant du sang dans l’aorte. Une fois que la perfusion a été effectuée correctemen...

La calcification est le prédicteur le plus significatif de la mortalité et de la morbidité par maladie cardiovasculaire1. La calcification modifie la mécanique de la paroi artérielle en raison de l’accumulation de minéraux de calcium et de phosphate2. Dans l’athérosclérose, la calcification peut exacerber le stress local et entraîner la rupture de la plaque, qui est la principale cause de crises cardiaques. La calcification médiale, souvent due à une maladie rénale chronique, est plus répandue et entraîne un raidissement artériel important, un dysfonctionnement et une surcharge cardiaque 2,3. Actuellement, il n’existe aucune option thérapeutique pour le traitement ou la prévention de la calcification vasculaire.
Les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) adoptent un phénotype semblable à celui des ostéoblastes et libèrent des vésicules extracellulaires calcifiantes (VE) qui nucléent les minéraux naissants, entraînant ainsi la calcification 4,5,6. Ce processus ressemble à la minéralisation physiologique des ostéoblastes dans l’os7. Bien que le critère d’évaluation de la minéralisation soit similaire dans la paroi vasculaire et la matrice osseuse, les mécanismes par lesquels les VE calcifiants proviennent diffèrent dans les deux tissus8. Il existe de nombreux types de modèles utilisés pour étudier la calcification vasculaire. In vitro, les modèles de culture cellulaire imitent la transition ostéogénique des VSMC et la formation subséquente de minéraux avec des milieux spécialisés.
Lors de l’étude de la calcification in vivo, le modèle utilisé dépend du type de calcification étudié. Des modèles murins hyperlipidémiques sont souvent utilisés pour étudier la calcification athéroscléreuse, qui apparaît plus focale dans les plaques riches en lipides9. En revanche, la calcification médiale est plus répandue dans tout le système vasculaire et est souvent étudiée à l’aide de modèles de maladie rénale chronique qui utilisent un régime riche en adénine pour induire une insuffisance rénale ou des techniques chirurgicales pour enlever des parties importantes des reins10,11. Les modèles agressifs de calcification vasculaire ont utilisé une combinaison de modèles d’hyperlipidémie et d’insuffisance rénale chronique12. Ce protocole fournit une méthode pour évaluer la calcification vasculaire dans les aortes murines pour la calcification médiale et athéroscléreuse, extraire les VE de la paroi aortique et observer le potentiel de minéralisation dans les VE obtenus à partir de modèles de culture cellulaire in vitro. Les études futures pourront utiliser ces procédures dans les analyses mécanistes de la calcification vasculaire et pour évaluer les interventions thérapeutiques potentielles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155409PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 inch Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, High Concentraion, Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-8254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dish</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-90-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pan and Wax</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>DSPA01-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>DLx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)&#160;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B11229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680EX</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A4782602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multimode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 96-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>TPIN02-PK/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde, et la calcification vasculaire est le prédicteur le plus important des événements cardiovasculaires; Cependant, il n’existe actuellement aucun traitement ou option thérapeutique pour la calcification vasculaire. La calcification commence dans des vésicules extracellulaires spécialisées (VE), qui servent de foyers de nucléation en agrégeant les ions calcium et phosphate. Ce protocole décrit les méthodes permettant d’obtenir et d’évaluer la calcification dans les aortes murines et d’analyser les VE extraites associées. Tout d’abord, la dissection grossière de la souris est effectuée pour collecter tous les organes pertinents, tels que les reins, le foie et les poumons. Ensuite, l’aorte murine est isolée et excisée de la racine aortique à l’artère fémorale. Deux à trois aortes sont ensuite regroupées et incubées dans une solution digestive avant de subir une ultracentrifugation pour isoler les VE d’intérêt. Ensuite, le potentiel de minéralisation des VE est déterminé par incubation dans une solution à haute teneur en phosphate et mesure de l’absorbance de la lumière à une longueur d’onde de 340 nm. Enfin, les hydrogels de collagène sont utilisés pour observer la formation et la maturation des minéraux calcifiés produits par les VE in vitro.

Une fois les aortes extraites, l’imagerie à l’aide d’un scanner optique proche infrarouge montre une représentation visuelle de l’aorte ainsi que de la calcification vasculaire (Figure 1). Les valeurs d’intensité en pixels dans l’image fluorescente numérisée représentent la distribution de la calcification et sont affichées ici à l’aide d’une carte thermique colorée. Les méthodes de quantification comprennent l’identification d’un seuil positif et la déclaratio...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models at JoVE.com

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Cet article présente la méthodologie pour obtenir et évaluer la calcification vasculaire en isolant les aortes murines suivie de l’extraction des vésicules extracellulaires calcifiées pour observer le potentiel de minéralisation.

Analyse de la calcification vasculaire extracellulaire à médiation vésiculaire à l’aide de modèles in vitro et in vivo

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Ce protocole fournit une méthode qui peut être utilisée pour aider à évaluer et, à l’avenir, à développer des traitements pour la calcification vasculaire, qui est le prédicteur le plus important de maladie cardiovasculaire. La capacité d’isoler les VE nous permet d’étudier plus avant les mécanismes qui conduisent à la calcification vasculaire et au changement phénotypique des cellules musculaires lisses vasculaires. Cette technique donne un aperçu des mécanismes moléculaires précoces de la calcification médiée par les cellules musculaires lisses vasculaires.Comprendre cela permet d’étudier les options thérapeutiques pour le mécanisme compris. Tous les véhicules électriques d’intérêt peuvent être étudiés à l’aide de cette méthode. Il n’est pas exclusif aux cellules musculaires lisses vasculaires, aux ostéoblastes ou à la calcification vasculaire.Après avoir euthanasié la souris, soulevez la peau à l’aide d’une pince à épiler et faites une incision le long de la ligne médiane. Enlevez tout excès de peau ou de graisse. Ensuite, retirez les organes reproducteurs, la vessie et la graisse à l’extérieur de la ligne médiane.Ensuite, déplacez les organes gastro-intestinaux vers la droite et suivez les intestins dans la ligne médiane. Une fois trouvé, soulevez la ligne médiane et excisez le tractus gastro-intestinal jusqu’à l’estomac. Extrayez les reins en les soulevant loin de la ligne médiane.Couper le plus près possible du rein. Enlevez le foie en soulevant les lobes et en coupant loin de la ligne médiane. Ensuite, perfusez le cœur et l’aorte en injectant du PBS froid dans le ventricule droit à l’aide d’une seringue de 10 millilitres.Attendez que les poumons se gonflent et deviennent blancs. Retirez les poumons et tout excès de diaphragme ou de cage thoracique. Pour retirer l’os, ouvrez une paire de ciseaux en grand et placez-les dans la partie inférieure de la souris au-dessus de la queue.Couper vers le bas, soulever la colonne vertébrale de la peau et enlever la graisse des côtés de la ligne médiane. Une fois que la peau est détachée, excisez la colonne vertébrale et les organes intacts en coupant juste au-dessus du cœur. Placez la colonne vertébrale et les organes intacts dans un bécher de PBS dans le seau à glace si vous les transportez vers un stéréoscope.Après avoir déplacé la colonne vertébrale et les organes dans le plat de dissection, remplissez-le de PBS glacé et épinglez la colonne vertébrale et la cage thoracique à l’aide d’aiguilles. Sous le microscope à dissection, soulevez le cœur avec précaution à l’aide d’une pince à épiler et commencez à couper au-dessus de la colonne vertébrale et sous l’aorte. Continuez jusqu’à ce que le bas de la colonne vertébrale soit atteint.Retirez la colonne vertébrale du plat à disséquer et épinglez le cœur et toute graisse ou muscle étranger. En partant de la zone située juste en dessous du cœur, identifiez l’œsophage, la veine cave et l’aorte. Retirez l’œsophage et la veine cave pour avoir un champ visuel clair de l’aorte.À l’aide de la pince à micro-dissection et des ciseaux, commencez à soulever le tissu adipeux et coupez le plus près possible de l’aorte. Continuez ainsi le long de la ligne médiale jusqu’à ce que toutes les artères de l’aorte et du fémur soient exposées. Au cœur, retirez tout le tissu adipeux exposant les trois branches de l’arc aortique.Retirez la racine aortique du ventricule gauche en insérant les ciseaux de micro-dissection dans le ventricule gauche et en coupant le muscle entourant l’aorte. Une fois l’aorte isolée et nettoyée, imagez l’aorte à l’aide d’un scanner proche infrarouge pour visualiser la calcification vasculaire. À l’aide du script MATLAB personnalisé, quantifiez le signal total du traceur calcique normalisé à la surface totale de l’aorte balayée.Dirigez le MATLAB vers l’emplacement des fichiers TIF à partir de l’analyse proche infrarouge des aortes, ouvrez les fichiers individuels et extrayez les valeurs d’intensité en pixels des fichiers TIF. Sélectionnez l’aorte avec la plus grande calcification comme échelle maximale sur l’image mappée en couleur. Lorsque la commande Combien de spécimens sont dans l’image apparaît dans la fenêtre, entrez le nombre d’aortes dans l’image actuelle et sélectionnez chaque aorte une par une.Une fois l’aorte sélectionnée, MATLAB crée des images binaires avec un masque de la surface totale et de la zone calcifiée de l’aorte. Les valeurs de ces images masquées sont ensuite utilisées pour déterminer la surface calcifiée totale, la surface totale de l’aorte, le pourcentage de surface positive pour la calcification et l’intensité moyenne de la zone calcifiée. Immédiatement après avoir scanné les aortes, mettez deux à trois aortes pour obtenir une concentration suffisante en protéines.Incuber deux à trois aortes regroupées dans 1,5 millilitre de solution digestive pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Recueillir la solution et centrifuger à 1 000 g pendant 15 minutes pour éliminer les débris cellulaires. Ensuite, pour retirer les microvésicules, centrifuger à nouveau le surnageant pendant 30 minutes à 33 000 g.Recueillir et évaluer le surnageant pour le potentiel de calcification. Après avoir retiré les débris cellulaires du milieu collecté conditionné par centrifugation, faire tourner le surnageant recueilli à 33 000 g pendant 30 minutes. Récupérez le surnageant et transférez-le dans un nouveau tube.Ajoutez ensuite 1% de 300 millimolaires de dihydrogénophosphate de sodium aux échantillons de vésicules extracellulaires et mélangez la solution par pipetage. Transférer 200 microlitres de la solution de mélange dans une plaque de 96 puits et incuber la plaque de 96 puits dans le lecteur de microplaques à 37 degrés Celsius. Réglez le lecteur de plaques pour enregistrer l’absorbance à une longueur d’onde de 340 nanomètres toutes les minutes.Pipeter 300 microlitres de la solution de collagène dans chaque puits d’une chambre de verre à huit puits, et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Après l’incubation, ajoutez 300 microlitres de DMEM comme témoin dans les puits. Ajouter 300 microlitres des échantillons de milieu de vésicules extracellulaires prélevés précédemment dans les puits restants et incuber pendant six jours, comme démontré précédemment.Le 10e jour, pipeter 2,5 microlitres du mélange OsteoSense et DMEM dans chaque puits et incuber pendant 24 heures. À la fin de l’incubation, imagez les hydrogels avec des filtres pour la fluorescence OsteoSense à travers le bas d’une chambre de verre à l’aide d’un microscope inversé, ou du haut avec un objectif à longue distance de travail. Évaluez le nombre de calcifications, la taille de calcification et les images collectées à l’aide des options d’analyse des particules disponibles dans ImageJ.Accédez ensuite à Image, sélectionnez Ajuster, puis cliquez sur Seuil pour binariser les images, de sorte que seul le signal OsteoSense apparaisse en blanc. Utilisez ensuite la commande Analyser, puis cliquez sur Analyser les particules pour obtenir des informations sur chaque calcification de l’image. Utilisez les mêmes paramètres de seuil pour assurer la cohérence de chaque image analysée.L’imagerie par scanner optique proche infrarouge des aortes disséquées a montré un signal OsteoSense plus élevé dans toute l’aorte d’une souris atteinte d’insuffisance rénale chronique que les deux aortes de souris témoins. Le milieu conditionné obtenu à partir de cellules musculaires lisses vasculaires cultivées dans un milieu pro-calcifié a montré une absorbance plus élevée à 340 nanomètres que le milieu témoin. L’augmentation de l’absorbance s’est produite 1,5 fois plus rapidement dans l’échantillon pro-calcifié que dans un échantillon témoin.Le milieu conditionné à partir de cellules cultivées dans des conditions pro-calcifiantes contenait des dépôts minéraux. Lors de la micro-dissection de l’aorte, il est important de couper soigneusement la graisse entourant l’aorte. Vous voulez analyser autant d’aorte que possible, mais cela peut être assez fastidieux.Une fois les VE isolés, des tests supplémentaires, tels qu’un test d’activité de la phosphatase alcaline, ou immuno-corps pourraient être effectués. Ces tests montreraient en outre les mécanismes et les protéines présents dans les VE.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analyse de Schwann-astrocytes interactions à l&#39;aide In Vitro Tests

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Recherche

Biologie

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo et in vitro de l&#39;adaptateur-clathrine Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualisation de MG53 médiation réparation de la membrane cellulaire utilisant In vivo Et In vitro Systèmes

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Cryoconservation du sperme de souris et de récupération utilisant les I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

La synthèse in vitro de l&#39;ARNm modifié pour l&#39;induction de l&#39;expression des protéines dans les cellules humaines

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Mesure de la rigidité de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris aortes Utiliser Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Techniques de phénotypage micron-échelle de maïs faisceaux vasculaires issu de tomographie à rayons x Microcomputed

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Mesure du métabolisme énergétique chez Explanté tissu rétinien en utilisant l’analyse de Flux extracellulaire

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Analyse du microbiote à l'aide de PCR en deux étapes et de la prochaine génération 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...