Name: analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models
Uploaded: 2023-01-27T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי ללב, ריאות ודם של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (1R01HL160740 ו- 5 T32GM132054-04) והקרן לחקר הלב של פלורידה. ברצוננו להודות לקסנדרה גומז על עזרתה בסינתזה ובהדמיה של ההידרוג'לים.

העבודה in vivo אושרה ופוקחה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטה הבינלאומית של פלורידה ותאמה את ההנחיות הנוכחיות של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). עבור פרוטוקול זה, ההליך אינו שונה בהתאם למתח, משקל, גיל ומין של העכבר. סוג ההסתיידות הנחקר, הדיאטות והטיפולים עשויי...

<ol>
	<li>Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+mediators+of+cardiovascular+calcification.">Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).</li><li>Ho, C. Y., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+arterial+calcification:+an+overlooked+player+in+peripheral+arterial+disease.">Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).</li><li>Marinelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+arterial+media+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease.</a> Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).</li><li>Moe, S. M., Chen, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).</li><li>Mir, B., Goettsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+delivery+vehicles+of+specific+cellular+cargo.">Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo.</a> Cells. 9 (7), 1601 (2020).</li><li>Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification:+Current+controversies+and+novel+concepts.">Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).</li><li>New, S. E., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+vesicles+in+de+novo+mineralization:+An+additional+novel+mechanism+of+cardiovascular+calcification.">Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).</li><li>Aikawa, E., Hutcheson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , (2020).</li><li>Johnson, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-407-induced+murine+model+of+dose-controlled+hyperlipidemia+and+atherosclerosis:+A+review+of+findings+to+date.">The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).</li><li>Shobeiri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+animal+models+of+CKD:+A+review.">Vascular calcification in animal models of CKD: A review.</a> American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).</li><li>El-Abbadi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+feeding+induces+arterial+medial+calcification+in+uremic+mice:+role+of+serum+phosphorus,+fibroblast+growth+factor-23,+and+osteopontin.">Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin.</a> Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).</li><li>Veseli, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li><li>Chen, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase+2+accelerates+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease.</a> American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).</li><li>Wu, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+the+nucleational+core+of+matrix+vesicles.">Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).</li><li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques.">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).</li></ol>

בעת ביצוע הפרוטוקול, חשוב לציין את השלבים הקריטיים להשגת תוצאות מוצלחות. במהלך הבידוד של אבי העורקים murine, זה חיוני כי זילוח מבוצע כראוי. בעת הזרקת PBS, יש להקפיד לא לנקב את החדר הימני. זה יגרום לנוזל לדלוף ישירות מהחדר ולא לזרום דרך הריאות, מה שמשאיר דם בתוך אבי העורקים. לאחר שהזילוח בוצע כראו?...

הסתיידות היא המנבא המשמעותי ביותר לתמותה ותחלואה ממחלות לב וכלי דם1. הסתיידות משנה את מכניקת דופן העורקים עקב הצטברות מינרלים של סידן ופוספט2. בטרשת עורקים, הסתיידות עלולה להחמיר את הלחץ המקומי ולגרום לקרע פלאק, שהוא הגורם המוביל להתקפי לב. הסתיידות מדיאלית - הנובעת לעתים קרובות ממחלת כליות כרונית - נפוצה יותר ומובילה להתקשות עורקים משמעותית, תפקוד לקוי ועומס יתר לבבי 2,3. נכון לעכשיו, אין אפשרויות טיפוליות לטיפול או מניעה של הסתיידות כלי הדם.
תאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs) מאמצים פנוטיפ דמוי אוסטאובלסט ומשחררים שלפוחיות חוץ-תאיות מסתיידות (EVs) המעוררות מינרלים מתהווים, ובכך מניעות הסתיידות 4,5,6. תהליך זה דומה למינרליזציה פיזיולוגית של אוסטאובלסטים בעצם7. למרות שנקודת הסיום של מינרליזציה דומה בדופן כלי הדם ובמטריצת העצם, המנגנונים שבאמצעותם נוצרים כלי הרכב החשמליים המסוידים שונים בשתי הרקמות8. ישנם סוגים רבים של מודלים המשמשים לחקר הסתיידות כלי הדם. במבחנה, מודלים של תרביות תאים מחקים את המעבר האוסטאוגני של VSMCs והיווצרות מינרלים לאחר מכן עם מדיה מיוחדת.
כאשר לומדים הסתיידות in vivo, המודל המשמש תלוי בסוג ההסתיידות הנחקרת. מודלים של עכברים היפרליפידמיים משמשים לעתים קרובות לחקר הסתיידות טרשת עורקים, אשר נראית ממוקדת יותר בתוך רבדים עשירים בשומנים9. לעומת זאת, הסתיידות מדיאלית נפוצה יותר בכל כלי הדם ונחקרת לעתים קרובות באמצעות מודלים של מחלת כליות כרונית המשתמשים במשטר תזונה עשיר באדנין כדי לגרום לאי ספיקת כליות או טכניקות כירורגיות להסרת חלקים משמעותיים של הכליות10,11. מודלים אגרסיביים של הסתיידות כלי דם השתמשו בשילוב של מודלים של מחלת כליות היפרליפידמית וכרונית12. פרוטוקול זה מספק שיטה להערכת הסתיידות כלי הדם באבי העורקים המוריני עבור הסתיידות מדיאלית וטרשת עורקים, חילוץ EVs מדופן אבי העורקים, וצפייה בפוטנציאל המינרליזציה ברכבים חשמליים המתקבלים ממודלים של תרביות תאים במבחנה. מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בפרוצדורות אלה בניתוחים מכניסטיים של הסתיידות כלי דם ולהעריך התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155409PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 inch Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, High Concentraion, Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-8254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dish</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-90-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pan and Wax</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>DSPA01-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>DLx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)&#160;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B11229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680EX</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A4782602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multimode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 96-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>TPIN02-PK/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models

מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה בעולם, והסתיידות כלי הדם היא המנבא המשמעותי ביותר לאירועים קרדיווסקולריים; עם זאת, אין כיום אפשרויות טיפול או טיפול להסתיידות כלי דם. ההסתיידות מתחילה בשלפוחיות חוץ-תאיות מיוחדות (EVs), המשמשות כמוקדי נוקלציה על ידי צבירת יוני סידן ופוספט. פרוטוקול זה מתאר שיטות להשגה והערכה של הסתיידות באבי העורקים וניתוח כלי הרכב החשמליים שחולצו הקשורים. ראשית, דיסקציה גסה של העכבר מבוצעת כדי לאסוף איברים רלוונטיים, כגון הכליות, הכבד והריאות. לאחר מכן, אבי העורקים מבודד ונכרת מהשורש אבי העורקים לעורק הירך. לאחר מכן שניים עד שלושה אבי עורקים נאגרים ומודגרים בתמיסת עיכול לפני שהם עוברים אולטרה-צנטריפוגה כדי לבודד את כלי הרכב החשמליים המעניינים. לאחר מכן, פוטנציאל המינרליזציה של כלי הרכב החשמליים נקבע באמצעות דגירה בתמיסת פוספט גבוהה ומדידת בליעת האור באורך גל של 340 ננומטר. לבסוף, הידרוג'לים של קולגן משמשים לצפייה בהיווצרות ובהבשלה של מינרלים מסוידים המיוצרים על ידי כלי רכב חשמליים במבחנה.

לאחר חילוץ אבי העורקים, הדמיה באמצעות סורק אופטי אינפרא-אדום קרוב מראה ייצוג חזותי של אבי העורקים כמו גם של הסתיידות כלי הדם (איור 1). ערכי עוצמת הפיקסלים בתמונה הפלואורסצנטית הסרוקה מייצגים את התפלגות ההסתיידות ומוצגים כאן באמצעות מפת חום צבעונית. שיטות הכימות כוללות זיהו...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models at JoVE.com

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

מאמר זה מציג את המתודולוגיה להשגת והערכת הסתיידות כלי הדם על ידי בידוד אבי העורקים של מורין ואחריו חילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות מסוידות כדי לבחון את פוטנציאל המינרליזציה.

ניתוח הסתיידות כלי דם חוץ-תאית בתיווך שלפוחית באמצעות מודלים In Vitro ו-In Vivo

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

פרוטוקול זה מספק שיטה שניתן להשתמש בה כדי לסייע בהערכה, ובעתיד, לסייע בפיתוח טיפולים להסתיידות כלי דם, שהיא המנבא המשמעותי ביותר למחלות לב וכלי דם. היכולת לבודד כלי רכב חשמליים מאפשרת לנו להמשיך ולחקור את המנגנונים המובילים להסתיידות כלי הדם, ואת השינוי הפנוטיפי של תאי שריר חלק בכלי הדם. טכניקה זו מספקת תובנה לגבי מנגנונים מולקולריים מוקדמים של הסתיידות תאי שריר חלק וסקולרית.הבנה זו מאפשרת ללמוד אפשרויות טיפוליות עבור המנגנון המובן. כל כלי רכב חשמליים מעניינים ניתן ללמוד בשיטה זו. הוא אינו בלעדי לתאי שריר חלק של כלי הדם, אוסטאובלסטים או הסתיידות כלי דם.לאחר המתת העכבר, הרימו את העור באמצעות פינצטה, ובצעו חתך לאורך קו האמצע. הסירו עודפי עור או שומן. לאחר מכן הסר את איברי הרבייה, שלפוחית השתן והשומן מחוץ לקו האמצע.לאחר מכן להזיז את איברי העיכול לצד ימין ולעקוב אחר המעיים בקו האמצע. לאחר המציאה, להרים את קו האמצע, ו הבלו את מערכת העיכול עד הבטן. הבלו את הכליות על ידי הרמת אותם מקו האמצע.לחתוך קרוב ככל האפשר לכליה. הסר את הכבד על ידי הרמת האונות וחיתוך מקו האמצע. לאחר מכן לחורר את הלב ואת אבי העורקים על ידי הזרקת PBS קר לחדר הימני באמצעות מזרק 10 מיליליטר.חכו שהריאות יתנפחו, ויהפכו ללבנות. הסר את הריאות וכל עודף דיאפרגמה, או כלוב צלעות. כדי להסיר את העצם, פתח זוג מספריים לרוחב והנח אותם באזור התחתון של העכבר מעל הזנב.חותכים כלפי מטה, מרימים את עמוד השדרה מהעור ומסירים את השומן מצידי קו האמצע. ברגע שהעור מנותק, הבלו את עמוד השדרה ואת האיברים השלמים על ידי חיתוך ממש מעל הלב. הניחו את עמוד השדרה ואת האיברים השלמים בכוס של PBS בדלי הקרח אם מעבירים אותם לסטריאוסקופ.לאחר העברת עמוד השדרה והאיברים לתוך צלחת הניתוח, מלאו אותו ב-PBS קר כקרח, וננעצו את עמוד השדרה וכלוב הצלעות באמצעות מחטים. תחת מיקרוסקופ דיסקציה מרימים את הלב בזהירות באמצעות פינצטה, ומתחילים לחתוך מעל עמוד השדרה, ומתחת לאבי העורקים. המשיכו בכך עד שמגיעים לתחתית עמוד השדרה.הסר את עמוד השדרה מצלחת הניתוח, ונעץ את הלב וכל שומן חיצוני, או שריר. החל מהאזור ממש מתחת ללב, זהה את הוושט, הווריד הנבוב ואבי העורקים. הסר את הוושט ואת נבוב הווריד כדי לקבל שדה ראייה ברור של אבי העורקים.בעזרת מלקחיים מיקרו-דיסקציה ומספריים, מתחילים להרים את רקמת השומן, ולחתוך קרוב ככל האפשר לאבי העורקים. יש להמשיך בקו המדיאלי עד לחשיפת כל אבי העורקים ועורקי הירך. בלב, להסיר את כל רקמת השומן לחשוף את שלושת הענפים בקשת אבי העורקים.הסר את שורש אבי העורקים מהחדר השמאלי על ידי החדרת מספריים מיקרו דיסקציה לחדר שמאל, וחיתוך השריר המקיף את אבי העורקים. לאחר בידוד וניקוי אבי העורקים, דמיינו את אבי העורקים באמצעות סורק אינפרא אדום קרוב כדי להמחיש הסתיידות כלי דם. באמצעות סקריפט MATLAB מותאם אישית, כמת את האות הכולל של עוקב הסידן המנורמל לאזור אבי העורקים הסרוק הכולל.כוונו את ה- MATLAB למיקום קובצי TIF מסריקת כמעט אינפרא-אדום של אבי העורקים, פתחו את הקבצים הבודדים וחלצו את ערכי עוצמת הפיקסלים מקובצי TIF. בחרו באבי העורקים עם ההסתיידות הגדולה ביותר כגודל המידה המרבי בתמונה הממופה בצבע. כאשר הפקודה כמה דגימות יש בתמונה מופיעה על החלון, הזן את מספר אבי העורקים בתמונה הנוכחית ובחר כל אבי עורקים בזה אחר זה.לאחר בחירת אבי העורקים, MATLAB תיצור תמונות בינאריות עם מסיכה של השטח הכולל והאזור המסויד של אבי העורקים. הערכים מתמונות מסיכות אלה משמשים לאחר מכן לקביעת השטח הכולל המסויד, השטח הכולל של אבי העורקים, אזור האחוזים החיוביים להסתיידות והעוצמה הממוצעת של האזור המסויד. מיד לאחר סריקת אבי העורקים, אגרו שניים עד שלושה אבי עורקים כדי להניב ריכוז חלבון מספיק.יש לדגור על שניים עד שלושה אבי עורקים ב-1.5 מיליליטר של תמיסת עיכול למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאסוף את הפתרון ואת הצנטריפוגה ב 1, 000 גרם במשך 15 דקות כדי להסיר פסולת התא. לאחר מכן, כדי להסיר את microvesicles, צנטריפוגה supernatant שוב במשך 30 דקות ב 33, 000 גרם.לאסוף ולהעריך את supernatant עבור פוטנציאל הסתיידות. לאחר הסרת פסולת התא מן התווך המותנה שנאסף על ידי צנטריפוגה, לסובב את supernatant שנאסף ב 33, 000 גרם במשך 30 דקות. אספו את הסופרנאטנט והעבירו אותו לצינור חדש.לאחר מכן הוסף 1% של 300 מילימולר נתרן דימימן פוספט לדגימות שלפוחית חוץ-תאית, וערבב את התמיסה על ידי pipetting. מעבירים 200 מיקרוליטר מתמיסת התערובת לצלחת בת 96 בארות, ודגרים על הצלחת בת 96 הקידוחים בקורא המיקרו-צלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הגדר את קורא הלוחות להקליט את הבליעה באורך גל של 340 ננומטר כל דקה.פיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסת הקולגן לתוך כל באר של זכוכית בעלת שמונה בארות, ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% במשך 72 שעות. לאחר הדגירה, להוסיף 300 מיקרוליטר של DMEM כבקרה לתוך הבארות. הוסף 300 מיקרוליטר של דגימות בינוניות שלפוחית חוץ-תאית שנאספו בעבר לבארות הנותרות, ודגר במשך שישה ימים, כפי שהודגם קודם לכן.ביום העשירי, פיפטה 2.5 מיקרוליטר של תערובת OsteoSense ו- DMEM לכל באר, ולדגור במשך 24 שעות. בסוף הדגירה, דמיינו את ההידרוג'לים עם פילטרים לפלואורסצנטיות של OsteoSense דרך החלק התחתון של תא זכוכית כיסוי באמצעות מיקרוסקופ הפוך, או מלמעלה עם מטרה למרחק עבודה ארוך. הערך את מספר ההסתיידויות ואת גודל ההסתיידות ואת התמונות שנאספו באמצעות אפשרויות ניתוח החלקיקים הזמינות ב- ImageJ.לאחר מכן נווטו אל 'תמונה', בחרו 'התאמה' ולחצו על 'סף' כדי לבצע בינאריזציה של התמונות, כך שרק אות OsteoSense יופיע לבן. לאחר מכן השתמשו בפקודה 'נתח' ולחצו על הפקודה 'נתח חלקיקים' לקבלת מידע לכל הסתיידות בתמונה. השתמש באותם פרמטרי סף לקבלת עקביות עבור כל תמונה שנותחה.הדמיית סורק אופטי קרוב לאינפרא-אדום של אבי העורקים שנותח הראתה אות OsteoSense גבוה יותר בכל אבי העורקים של עכבר עם מחלת כליות כרונית מאשר שני אבי העורקים מעכברי ביקורת. התווך המותנה שהתקבל מתאי שריר חלק של כלי דם שגודלו בתווך פרו-קלציפיסטי הראה ספיגה גבוהה יותר ב-340 ננומטר מאשר מדיום הביקורת. העלייה בספיגה התרחשה פי 1.5 מהר יותר במדגם פרו-קלציפי בהשוואה לדגימת ביקורת.התווך המותנה מתאים שגודלו בתרבית בתנאים פרו-קלציפיים הכיל מרבצי מינרלים. בעת ניתוח מיקרו של אבי העורקים, חשוב לחתוך את השומן סביב אבי העורקים בזהירות. אתה רוצה כמה שיותר של אבי העורקים לנתח, אבל זה יכול להיות די מייגע.לאחר בידוד כלי הרכב החשמליים, ניתן יהיה להשלים בדיקות נוספות, כגון בדיקת פעילות אלקליין פוספטאז, או גוף חיסוני. בדיקות אלה יראו עוד יותר את המנגנונים והחלבונים הקיימים ברכב חשמלי.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo ו במבחנה של אינטראקציה מתאם-clathrin

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

ויזואליזציה של תיקון MG53 בתיווך קרום התא באמצעות In vivo ו במבחנה מערכות

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

במבחנת הסינתזה של mRNA השתנה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים אנושיים

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

טכניקות Phenotyping בקנה מידה מיקרון של חבילות וסקולריים תירס מבוסס על צילום רנטגן טומוגרפיה Microcomputed

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...