Name: analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models
Uploaded: 2023-01-27T14:50:00
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इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) (1आर01एचएल160740 और 5 टी 32 जीएम 132054-04) और फ्लोरिडा हार्ट रिसर्च फाउंडेशन के नेशनल हार्ट, लंग और ब्लड इंस्टीट्यूट से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम हाइड्रोगेल को संश्लेषित और इमेजिंग करने में मदद के लिए कासंद्रा गोमेज़ को धन्यवाद देना चाहते हैं।

फ्लोरिडा इंटरनेशनल यूनिवर्सिटी में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा विवो कार्य को अनुमोदित और देखरेख की गई थी और वर्तमान राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) दिशानिर्देशों ?...

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	<li>Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+mediators+of+cardiovascular+calcification.">Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).</li><li>Ho, C. Y., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+arterial+calcification:+an+overlooked+player+in+peripheral+arterial+disease.">Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).</li><li>Marinelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+arterial+media+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease.</a> Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).</li><li>Moe, S. M., Chen, N. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , (2020).</li><li>Johnson, T. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+feeding+induces+arterial+medial+calcification+in+uremic+mice:+role+of+serum+phosphorus,+fibroblast+growth+factor-23,+and+osteopontin.">Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin.</a> Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).</li><li>Veseli, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li><li>Chen, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase+2+accelerates+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease.</a> American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).</li><li>Wu, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+the+nucleational+core+of+matrix+vesicles.">Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).</li><li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques.">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).</li></ol>

प्रोटोकॉल करते समय, सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण चरणों पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है। मुराइन महाधमनी के अलगाव के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि छिड़काव ठीक से किया जाए। पीबीएस इंजेक्ट करते समय,...

कैल्सीफिकेशन कार्डियोवैस्कुलर बीमारी की मृत्यु दरऔर रुग्णता का सबसे महत्वपूर्ण भविष्यवक्ता है। कैल्सीफिकेशन कैल्शियम और फॉस्फेट खनिजों के निर्माण के कारण धमनी दीवार यांत्रिकी को बदलदेता है। एथेरोस्क्लेरोसिस में, कैल्सीफिकेशन स्थानीय तनाव को बढ़ा सकता है और इसके परिणामस्वरूप पट्टिका टूट सकती है, जो दिल के दौरे का प्रमुख कारण है। मेडियल कैल्सीफिकेशन - अक्सर क्रोनिक किडनी रोग के परिणामस्वरूप - अधिक व्यापक है और महत्वपूर्ण धमनी कठोरता, शिथिलता और हृदय अधिभार 2,3 की ओर जाता है। वर्तमान में, संवहनी कैल्सीफिकेशन के उपचार या रोकथाम के लिए कोई चिकित्सीय विकल्प नहीं हैं।
संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (वीएसएमसी) एक ओस्टियोब्लास्ट जैसे फेनोटाइप को अपनाती हैं और कैल्सीफाइंग बाह्य पुटिकाओं (ईवी) को छोड़ती हैं जो नवजात खनिजों को न्यूक्लियेट करती हैं, इस प्रकार कैल्सीफिकेशन 4,5,6 को चलाती हैं। यह प्रक्रिया हड्डी 7 में ओस्टियोब्लास्ट के शारीरिक खनिज करण जैसादिखता है। यद्यपि खनिजीकरण का समापन बिंदु संवहनी दीवार और हड्डी मैट्रिक्स में समान है, तंत्र जिसके द्वारा कैल्सीफाइंग ईवी उत्पन्न होते हैं,दो ऊतकों में भिन्न होते हैं। कई प्रकार के मॉडल हैं जिनका उपयोग संवहनी कैल्सीफिकेशन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इन विट्रो में, सेल कल्चर मॉडल वीएसएमसी के ओस्टोजेनिक संक्रमण और बाद में विशेष मीडिया के साथ खनिज गठन की नकल करते हैं।
विवो कैल्सीफिकेशन में अध्ययन करते समय, उपयोग किया जाने वाला मॉडल अध्ययन किए जा रहे कैल्सीफिकेशन के प्रकार पर निर्भर करता है। हाइपरलिपिडेमिक माउस मॉडल का उपयोग अक्सर एथेरोस्क्लेरोटिक कैल्सीफिकेशन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, जो लिपिड युक्त सजीले टुकड़े9 के भीतर अधिक फोकल दिखाई देता है। इसके विपरीत, औसत दर्जे का कैल्सीफिकेशन पूरे वाहिका में अधिक व्यापक है और अक्सर क्रोनिक किडनी रोग मॉडल का उपयोग करके अध्ययन किया जाता है जो गुर्दे की विफलता को प्रेरित करने के लिए एडेनिन युक्त आहार आहार का उपयोग करते हैं या गुर्दे के महत्वपूर्ण हिस्सों को हटाने के लिए सर्जिकलतकनीकों को नियोजित करते हैं। संवहनी कैल्सीफिकेशन के आक्रामक मॉडल ने हाइपरलिपिडेमिक और क्रोनिक किडनी रोग मॉडल12 दोनों के संयोजन का उपयोग किया है। यह प्रोटोकॉल औसत दर्जे के और एथेरोस्क्लेरोटिक कैल्सीफिकेशन दोनों के लिए मुराइन महाधमनी में संवहनी कैल्सीफिकेशन का आकलन करने, महाधमनी दीवार से ईवी निकालने और इन विट्रो सेल कल्चर मॉडल से प्राप्त ईवी में खनिज क्षमता का अवलोकन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है। भविष्य के अध्ययन संवहनी कैल्सीफिकेशन के यंत्रवत विश्लेषण में और संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेपों का आकलन करने के लिए इन प्रक्रियाओं का उपयोग कर सकते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155409PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 inch Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, High Concentraion, Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-8254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dish</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-90-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pan and Wax</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>DSPA01-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>DLx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)&#160;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B11229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680EX</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A4782602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multimode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 96-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>TPIN02-PK/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models

कार्डियोवैस्कुलर बीमारी दुनिया में मौत का प्रमुख कारण है, और संवहनी कैल्सीफिकेशन कार्डियोवैस्कुलर घटनाओं का सबसे महत्वपूर्ण भविष्यवक्ता है; हालांकि, वर्तमान में संवहनी कैल्सीफिकेशन के लिए कोई उपचार या चिकित्सीय विकल्प नहीं हैं। कैल्सीफिकेशन विशेष बाह्य पुटिकाओं (ईवी) के भीतर शुरू होता है, जो कैल्शियम और फॉस्फेट आयनों को एकत्र करके न्यूक्लियेटेड फॉसी के रूप में काम करते हैं। यह प्रोटोकॉल मुराइन महाधमनी में कैल्सीफिकेशन प्राप्त करने और मूल्यांकन करने और संबंधित निकाले गए ईवी का विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करता है। सबसे पहले, माउस का सकल विच्छेदन किसी भी प्रासंगिक अंगों, जैसे गुर्दे, यकृत और फेफड़ों को इकट्ठा करने के लिए किया जाता है। फिर, मुराइन महाधमनी को महाधमनी जड़ से ऊरु धमनी तक अलग और उत्पादित किया जाता है। दो से तीन महाधमनी को फिर एक पाचन समाधान में पूल किया जाता है और रुचि के ईवी को अलग करने के लिए अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन से गुजरने से पहले इनक्यूबेट किया जाता है। इसके बाद, ईवी की खनिज क्षमता को उच्च-फॉस्फेट समाधान में इनक्यूबेशन और 340 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश अवशोषण को मापने के माध्यम से निर्धारित किया जाता है। अंत में, कोलेजन हाइड्रोगेल का उपयोग विट्रो में ईवी द्वारा उत्पादित कैल्सीफाइड खनिज गठन और परिपक्वता का निरीक्षण करने के लिए किया जाता है।

एक बार महाधमनी निकाले जाने के बाद, निकट-अवरक्त ऑप्टिकल स्कैनर का उपयोग करके इमेजिंग महाधमनी के साथ-साथ संवहनी कैल्सीफिकेशन का दृश्य प्रतिनिधित्व दिखाती है (चित्रा 1)। स्कैन किए गए फ्लोरोसे?...

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Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

यह पेपर खनिज क्षमता का निरीक्षण करने के लिए कैल्सीफाइड बाह्य पुटिकाओं को निकालने के बाद मुराइन महाधमनी को अलग करके संवहनी कैल्सीफिकेशन प्राप्त करने और मूल्यांकन करने के लिए पद्धति प्रस्तुत करता है।

इन विट्रो और विवो मॉडल का उपयोग करके एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिका-मध्यस्थता संवहनी कैल्सीफिकेशन का विश्लेषण

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

यह प्रोटोकॉल एक विधि प्रदान करता है जिसका उपयोग मूल्यांकन करने में मदद करने के लिए किया जा सकता है, और भविष्य में, संवहनी कैल्सीफिकेशन के लिए उपचार विकसित करने में मदद करता है, जो हृदय रोग का सबसे महत्वपूर्ण भविष्यवक्ता है। ईवी को अलग करने की क्षमता हमें संवहनी कैल्सीफिकेशन और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के फेनोटाइपिक परिवर्तन को जन्म देने वाले तंत्र का आगे अध्ययन करने की अनुमति देती है। यह तकनीक संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिका-मध्यस्थता कैल्सीफिकेशन के प्रारंभिक आणविक तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।इसे समझने से चिकित्सीय विकल्पों को समझने वाले तंत्र के लिए अध्ययन किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके रुचि के किसी भी ईवी का अध्ययन किया जा सकता है। यह संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिका, ओस्टियोब्लास्ट, या संवहनी कैल्सीफिकेशन के लिए अनन्य नहीं है।माउस को यूथेनाइज़ करने के बाद, चिमटी का उपयोग करके त्वचा को उठाएं, और मध्य रेखा के नीचे एक चीरा लगाएं। किसी भी अतिरिक्त त्वचा, या वसा को हटा दें। फिर मध्य रेखा के बाहर प्रजनन अंगों, मूत्राशय और वसा को हटा दें।फिर गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल अंगों को दाईं ओर ले जाएं और मध्य रेखा में आंतों का पालन करें। एक बार पाए जाने के बाद, मध्य रेखा को उठाएं, और जठरांत्र संबंधी मार्ग को पेट तक बढ़ाएं। किडनी को मध्य रेखा से दूर उठाकर आबकारी।जितना संभव हो सके किडनी के करीब काट लें। लोब को उठाकर और मध्य रेखा से काटकर यकृत को हटा दें। फिर 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके दाएं वेंट्रिकल में ठंडे पीबीएस इंजेक्ट करके दिल और महाधमनी को उत्तेजित करें।फेफड़ों के फुलने की प्रतीक्षा करें, और सफेद हो जाएं। फेफड़ों और किसी भी अतिरिक्त डायाफ्राम, या रिबकेज को हटा दें। हड्डी को हटाने के लिए, कैंची की एक जोड़ी को चौड़ा खोलें और उन्हें पूंछ के ऊपर माउस के निचले क्षेत्र में रखें।नीचे की ओर काटें, रीढ़ की हड्डी को त्वचा से उठाएं, और मध्य रेखा के किनारों से वसा को हटा दें। एक बार जब त्वचा अलग हो जाती है, तो हृदय के ठीक ऊपर काटकर रीढ़ और बरकरार अंगों को उत्तेजित करें। स्टीरियोस्कोप में परिवहन करते समय बर्फ की बाल्टी में पीबीएस के बीकर में रीढ़ और बरकरार अंगों को रखें।रीढ़ और अंगों को विच्छेदित डिश में ले जाने के बाद, इसे बर्फ के ठंडे पीबीएस से भरें, और सुइयों का उपयोग करके रीढ़ और रिबकेज को पिन करें। विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, चिमटी का उपयोग करके दिल को सावधानी से उठाएं, और रीढ़ की हड्डी के ऊपर और महाधमनी के नीचे काटना शुरू करें। इसे तब तक जारी रखें जब तक रीढ़ की हड्डी के निचले हिस्से तक नहीं पहुंच जाता।विच्छेदन डिश से रीढ़ की हड्डी को हटा दें, और दिल और किसी भी बाहरी वसा, या मांसपेशियों को पिन करें। दिल के ठीक नीचे के क्षेत्र से शुरू करके, अन्नप्रणाली, वेना कावा और महाधमनी की पहचान करें। महाधमनी के स्पष्ट दृश्य क्षेत्र के लिए अन्नप्रणाली और वेना कावा को हटा दें।सूक्ष्म-विच्छेदन बल और कैंची का उपयोग करके, वसा ऊतक को उठाना शुरू करें, और जितना संभव हो उतना महाधमनी के करीब काटें। जब तक सभी महाधमनी और ऊरु धमनियां उजागर न हो जाएं, तब तक इसे मेडियल लाइन के नीचे जारी रखें। दिल में, महाधमनी चाप में तीन शाखाओं को उजागर करने वाले सभी वसा ऊतक को हटा दें।बाएं वेंट्रिकल में सूक्ष्म-विच्छेदन कैंची डालकर और महाधमनी के आसपास की मांसपेशियों को काटकर बाएं वेंट्रिकल से महाधमनी जड़ को हटा दें। एक बार महाधमनी को अलग और साफ करने के बाद, संवहनी कैल्सीफिकेशन की कल्पना करने के लिए निकट-अवरक्त स्कैनर का उपयोग करके महाधमनी की छवि बनाएं। कस्टम MATLAB स्क्रिप्ट का उपयोग करते हुए, कैल्शियम ट्रेसर के कुल सिग्नल को कुल स्कैन किए गए महाधमनी क्षेत्र में सामान्यीकृत करें।MATLAB को महाधमनी के निकट-अवरक्त स्कैन से TIF फ़ाइलों के स्थान पर निर्देशित करें, अलग-अलग फ़ाइलें खोलें, और TIF फ़ाइलों से पिक्सेल तीव्रता मान निकालें। रंग मैप की गई छवि पर अधिकतम पैमाने के रूप में सबसे बड़े कैल्सीफिकेशन के साथ महाधमनी का चयन करें। जब कमांड, छवि में कितने नमूने हैं, विंडो पर दिखाई देते हैं, वर्तमान छवि में महाधमनी की संख्या इनपुट करते हैं, और प्रत्येक महाधमनी को एक-एक करके चुनते हैं।एक बार महाधमनी का चयन हो जाने के बाद, MATLAB कुल क्षेत्र और महाधमनी के कैल्सीफाइड क्षेत्र के मुखौटे के साथ द्विआधारी छवियां बनाएगा। इन नकाबपोश छवियों के मूल्यों का उपयोग तब कुल कैल्सीफाइड क्षेत्र, महाधमनी के कुल क्षेत्र, कैल्सीफिकेशन के लिए सकारात्मक प्रतिशत क्षेत्र और कैल्सीफाइड क्षेत्र की औसत तीव्रता निर्धारित करने के लिए किया जाता है। महाधमनी को स्कैन करने के तुरंत बाद, पर्याप्त प्रोटीन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए दो से तीन महाधमनी पूल करें।1.5 मिलीलीटर पाचन घोल में दो से तीन पूल किए गए महाधमनी को 37 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। सेल मलबे को हटाने के लिए 15 मिनट के लिए 1,000 ग्राम पर समाधान और सेंट्रीफ्यूज एकत्र करें। इसके बाद, माइक्रोवेसिकल्स को हटाने के लिए, 33,000 ग्राम पर 30 मिनट के लिए फिर से सतह पर तैरने वाले को सेंट्रीफ्यूज करें।कैल्सीफिकेशन क्षमता के लिए सतह पर तैरने वाले को इकट्ठा करें और उसका आकलन करें। सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा वातानुकूलित एकत्रित माध्यम से सेल मलबे को हटाने के बाद, एकत्रित सतह पर तैरने वाले को 30 मिनट के लिए 33,000 ग्राम पर घुमाएं। सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करें और इसे एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।फिर बाह्य पुटिका नमूनों में 300 मिलीमोलर सोडियम डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट का 1% जोड़ें, और पाइपिंग द्वारा समाधान मिलाएं। मिश्रण समाधान के 200 माइक्रोलीटर को 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें, और माइक्रोप्लेट रीडर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 96-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें। हर एक मिनट में 340 नैनोमीटर की तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण रिकॉर्ड करने के लिए प्लेट रीडर सेट करें।पिपेट कोलेजन समाधान के 300 माइक्रोलीटर को आठ-अच्छी तरह से कक्ष ग्लास के प्रत्येक कुएं में डालते हैं, और 72 घंटों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करते हैं। इनक्यूबेशन के बाद, कुओं में नियंत्रण के रूप में डीएमईएम के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें। शेष कुओं में पहले एकत्र किए गए बाह्य पुटिका माध्यम के नमूनों के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें, और छह दिनों के लिए इनक्यूबेट करें, जैसा कि पहले दिखाया गया था।10 वें दिन, प्रत्येक कुएं में ओस्टियोसेंस और डीएमईएम मिश्रण के 2.5 माइक्रोलीटर पिपेट करें, और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के अंत में, एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कवरग्लास कक्ष के तल के माध्यम से या लंबी कार्य दूरी के उद्देश्य के साथ शीर्ष से ओस्टियोसेंस फ्लोरेसेंस के लिए फिल्टर के साथ हाइड्रोगेल की छवि बनाएं। इमेजजे में उपलब्ध कण विश्लेषण विकल्पों का उपयोग करके कैल्सीफिकेशन की संख्या और कैल्सीफिकेशन आकार और एकत्रित छवियों का आकलन करें।फिर छवि पर नेविगेट करें, समायोजित करें का चयन करें, और छवियों को बिनाराइज करने के लिए दहलीज पर क्लिक करें, जैसे कि केवल ओस्टियोसेंस सिग्नल सफेद दिखाई देता है। फिर विश्लेषण का उपयोग करें, और छवि में प्रत्येक कैल्सीफिकेशन के लिए जानकारी प्राप्त करने के लिए कणों का विश्लेषण करें आदेश क्लिक करें। विश्लेषण की गई प्रत्येक छवि के लिए स्थिरता के लिए समान थ्रेशोल्ड पैरामीटर का उपयोग करें।विच्छेदित महाधमनी के निकट-अवरक्त ऑप्टिकल स्कैनर इमेजिंग ने नियंत्रित चूहों से दो महाधमनी की तुलना में क्रोनिक किडनी रोग वाले माउस की महाधमनी में एक उच्च ओस्टियोसेंस सिग्नल दिखाया। एक प्रो-कैल्सीफिक माध्यम में संवर्धित संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं से प्राप्त वातानुकूलित माध्यम ने नियंत्रण माध्यम की तुलना में 340 नैनोमीटर पर उच्च अवशोषण दिखाया। नियंत्रण नमूने की तुलना में प्रो-कैल्सीफिक नमूने में अवशोषण वृद्धि 1.5 गुना तेजी से हुई।प्रो-कैल्सीफिक स्थितियों में संवर्धित कोशिकाओं से वातानुकूलित माध्यम में खनिज जमा होते हैं। महाधमनी को सूक्ष्म-विच्छेदित करते समय, महाधमनी के आसपास की वसा को सावधानी से काटना महत्वपूर्ण है। आप विश्लेषण करने के लिए जितना संभव हो उतना महाधमनी चाहते हैं, लेकिन यह काफी थकाऊ हो सकता है।एक बार ईवी को अलग करने के बाद, अतिरिक्त परीक्षण, जैसे कि क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि परख, या इम्यूनो बॉडी को पूरा किया जा सकता है। ये परीक्षण आगे ईवी में मौजूद तंत्र और प्रोटीन को दिखाएंगे।

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

श्वान - astrocyte का उपयोग सहभागिता के विश्लेषण इन विट्रो में Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Vivo में और अडैप्टर क्लैथ्रिन इंटरेक्शन की इन विट्रो अध्ययन में

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

MG53 मध्यस्थता सेल झिल्ली का प्रयोग मरम्मत के विज़ुअलाइज़ेशन Vivo में और इन विट्रो में सिस्टम

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

माउस शुक्राणु cryopreservation और रिकवरी मैं · क्रायो किट का उपयोग

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

इन विट्रो संश्लेषण में मानव कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रेरण के लिए mRNA के संशोधित की

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

मापने की कठोरता<em&gt; पूर्व विवो</em&gt; माउस Aortas परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

एक्स-रे Microcomputed टोमोग्राफी के आधार पर मक्का संवहनी बंडलों की माइक्रोन स्केल Phenotyping तकनीक

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Extracellular फ्लक्स विश्लेषण का उपयोग Explanted रेटिना ऊतक में ऊर्जा चयापचय का मापन

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Microbiota विश्लेषण दो कदम पीसीआर और अगली पीढ़ी के 16S rRNA जीन अनुक्रमण का उपयोग

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

इन विट्रो E3 सर्वव्यापकिन लिगाज़ समारोह का विश्लेषण

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...