Name: analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models
Uploaded: 2023-01-27T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Heart, Lung and Blood Institute of National Institutes of Health (NIH) (1R01HL160740 og 5 T32GM132054-04) og Florida Heart Research Foundation. Vi vil gjerne takke Kassandra Gomez for hennes hjelp med å syntetisere og avbilde hydrogelene.

In vivo-arbeidet ble godkjent og overvåket av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Florida International University og i samsvar med gjeldende retningslinjer for National Institutes of Health (NIH). For denne protokollen varierer prosedyren ikke avhengig av musens belastning, vekt, alder og kjønn. Den type forkalkning som studeres, dietter og behandlinger kan endre lengden på studien og vekten av musen som brukes, og kan være avhengig av en bestemt stamme og kjønn av mus som brukes i stud...

<ol>
	<li>Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+mediators+of+cardiovascular+calcification.">Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).</li><li>Ho, C. Y., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+arterial+calcification:+an+overlooked+player+in+peripheral+arterial+disease.">Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).</li><li>Marinelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+arterial+media+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease.</a> Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).</li><li>Moe, S. M., Chen, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).</li><li>Mir, B., Goettsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+delivery+vehicles+of+specific+cellular+cargo.">Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo.</a> Cells. 9 (7), 1601 (2020).</li><li>Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification:+Current+controversies+and+novel+concepts.">Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).</li><li>New, S. E., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+vesicles+in+de+novo+mineralization:+An+additional+novel+mechanism+of+cardiovascular+calcification.">Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).</li><li>Aikawa, E., Hutcheson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , (2020).</li><li>Johnson, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-407-induced+murine+model+of+dose-controlled+hyperlipidemia+and+atherosclerosis:+A+review+of+findings+to+date.">The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).</li><li>Shobeiri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+animal+models+of+CKD:+A+review.">Vascular calcification in animal models of CKD: A review.</a> American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).</li><li>El-Abbadi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+feeding+induces+arterial+medial+calcification+in+uremic+mice:+role+of+serum+phosphorus,+fibroblast+growth+factor-23,+and+osteopontin.">Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin.</a> Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).</li><li>Veseli, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li><li>Chen, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase+2+accelerates+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease.</a> American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).</li><li>Wu, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+the+nucleational+core+of+matrix+vesicles.">Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).</li><li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques.">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).</li></ol>

Når du utfører protokollen, er det viktig å merke seg de kritiske trinnene for å oppnå vellykkede resultater. Under isolering av murine aorta er det viktig at perfusjonen utføres riktig. Ved injeksjon av PBS må det utvises forsiktighet for ikke å punktere høyre ventrikkel. Dette vil føre til at væsken lekker direkte ut av ventrikkelen og ikke klarer å sirkulere gjennom lungene, og etterlater blod i aorta. Når perfusjonen er utført riktig og mikrodisseksjon har begynt, må alt fett- og fettvev fjernes fra ao...

Forkalkning er den viktigste prediktoren for hjerte- og karsykdom, dødelighet og sykelighet1. Forkalkning endrer arterieveggmekanikken på grunn av opphopning av kalsium- og fosfatmineraler2. Ved aterosklerose kan forkalkning forverre lokalt stress og resultere i plakkbrudd, som er den viktigste årsaken til hjerteinfarkt. Medial forkalkning - ofte som følge av kronisk nyresykdom - er mer utbredt og fører til betydelig arteriell avstivning, dysfunksjon og hjerteoverbelastning 2,3. For tiden er det ingen terapeutiske alternativer for behandling eller forebygging av vaskulær forkalkning.
Vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) vedtar en osteoblastlignende fenotype og frigjør forkalkende ekstracellulære vesikler (EV) som kjerner begynnende mineraler, og driver dermed forkalkning 4,5,6. Denne prosessen ligner den fysiologiske mineraliseringen av osteoblaster i bein7. Selv om endepunktet for mineralisering er lik i vaskulærveggen og beinmatrisen, er mekanismene som de forkalkende EVene kommer fra, forskjellig i de to vevene8. Det finnes mange typer modeller som brukes til å studere vaskulær forkalkning. In vitro etterligner cellekulturmodeller den osteogene overgangen til VSMC og påfølgende mineraldannelse med spesialiserte medier.
Når man studerer in vivo forkalkning, avhenger modellen som brukes av hvilken type forkalkning som studeres. Hyperlipidemiske musemodeller brukes ofte til å studere aterosklerotisk forkalkning, som virker mer fokusert i lipidrike plakk9. I motsetning til dette er medial forkalkning mer utbredt gjennom vaskulaturen og studeres ofte ved hjelp av kroniske nyresykdomsmodeller som benytter et adeninrikt diettregime for å indusere nyresvikt eller kirurgiske teknikker for å fjerne betydelige deler av nyrene10,11. Aggressive modeller av vaskulær forkalkning har brukt en kombinasjon av både hyperlipidemiske og kroniske nyresykdomsmodeller12. Denne protokollen gir en metode for å vurdere vaskulær forkalkning i murine aorta for både mediale og aterosklerotiske forkalkninger, ekstrahere EV fra aortaveggen og observere mineraliseringspotensialet i EVene hentet fra in vitro cellekulturmodeller. Fremtidige studier kan bruke disse prosedyrene i mekanistiske analyser av vaskulær forkalkning og for å vurdere potensielle terapeutiske inngrep.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155409PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 inch Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, High Concentraion, Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-8254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dish</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-90-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pan and Wax</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>DSPA01-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>DLx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)&#160;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B11229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680EX</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A4782602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multimode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 96-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>TPIN02-PK/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models

Kardiovaskulær sykdom er den ledende dødsårsaken i verden, og vaskulær forkalkning er den viktigste prediktoren for kardiovaskulære hendelser; Imidlertid er det for tiden ingen behandling eller terapeutiske alternativer for vaskulær forkalkning. Forkalkning begynner i spesialiserte ekstracellulære vesikler (EV), som tjener som nukleerende foci ved å aggregere kalsium- og fosfationer. Denne protokollen beskriver metoder for å oppnå og vurdere forkalkning i murine aorta og analysere tilhørende ekstraherte EVer. Først utføres grov disseksjon av musen for å samle eventuelle relevante organer, for eksempel nyrer, lever og lunger. Deretter isoleres murine aorta og skjæres ut fra aortaroten til lårarterien. To til tre aortaer blir deretter samlet og inkubert i en fordøyelsesløsning før de gjennomgår ultrasentrifugering for å isolere elbilene av interesse. Deretter bestemmes mineraliseringspotensialet til elbilene gjennom inkubering i en høyfosfatløsning og måling av lysabsorbansen ved en bølgelengde på 340 nm. Til slutt brukes kollagenhydrogeler til å observere den forkalkede mineraldannelsen og modningen produsert av elbilene in vitro.

Når aortaene er ekstrahert, viser avbildning med nær-infrarød optisk skanner en visuell fremstilling av aorta så vel som vaskulær forkalkning (figur 1). Pikselintensitetsverdiene i det skannede fluorescerende bildet representerer fordelingen av forkalkning og vises her ved hjelp av et farget varmekart. Kvantifiseringsmetoder inkluderer å identifisere en positiv terskel og rapportere prosentvis areal av aorta med verdier større enn denne terskelverdien og / eller rapportere gjennomsnit...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models at JoVE.com

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Denne artikkelen presenterer metodikken for å oppnå og vurdere vaskulær forkalkning ved å isolere murine aorta etterfulgt av ekstraksjon av forkalkede ekstracellulære vesikler for å observere mineraliseringspotensialet.

Analyse av ekstracellulær vesikkelmediert vaskulær forkalkning ved bruk av in vitro og in vivo modeller

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Denne protokollen gir en metode som kan brukes til å vurdere, og i fremtiden, bidra til å utvikle behandlinger for vaskulær forkalkning, som er den viktigste prediktoren for kardiovaskulær sykdom. Evnen til å isolere elbiler lar oss studere mekanismene som fører til vaskulær forkalkning, og den fenotypiske forandringen av vaskulære glatte muskelceller. Denne teknikken gir innsikt i tidlige molekylære mekanismer for vaskulær glatt muskelcellemediert forkalkning.Å forstå dette gjør at terapeutiske alternativer kan studeres for den forståtte mekanismen. Eventuelle elbiler av interesse kan studeres ved hjelp av denne metoden. Det er ikke eksklusivt for vaskulær glatt muskelcelle, osteoblaster eller vaskulær forkalkning.Etter å ha avlivet musen, løft huden med pinsett, og gjør et snitt nedover midtlinjen. Fjern overflødig hud eller fett. Fjern deretter reproduktive organer, blære og fett utenfor midtlinjen.Flytt deretter gastrointestinale organer til høyre og følg tarmene i midtlinjen. Når funnet, løft midtlinjen, og excise mage-tarmkanalen opp til magen. Excise nyrene ved å løfte dem bort fra midtlinjen.Klipp så nær nyrene som mulig. Fjern leveren ved å løfte lobene og kutte vekk fra midtlinjen. Deretter perfusere hjertet og aorta ved å injisere kald PBS inn i høyre ventrikkel ved hjelp av en 10 milliliter sprøyte.Vent til lungene blåses opp, og bli hvite. Fjern lungene og overflødig membran eller brystkasse. For å fjerne beinet, åpne en saks bred og plasser dem i den nedre delen av musen over halen.Skjær nedover, løft ryggraden fra huden, og fjern fettet fra sidene av midtlinjen. Når huden er løsrevet, excise ryggraden og intakte organer ved å kutte rett over hjertet. Plasser ryggraden og intakte organer i et beger av PBS i isbøtta hvis du transporterer til et stereoskop.Etter å ha flyttet ryggraden og organene inn i dissekeringsfatet, fyll den med iskald PBS, og pin ned ryggraden og brystkassen ved hjelp av nåler. Under disseksjonsmikroskopet, løft hjertet forsiktig ved hjelp av pinsett, og begynn å kutte over ryggraden og under aorta. Fortsett dette til bunnen av ryggraden er nådd.Fjern ryggraden fra dissekeringsfatet, og pin ned hjertet og eventuelt fremmed fett eller muskel. Start fra området rett under hjertet, identifiser spiserøret, vena cava og aorta. Fjern spiserøret og vena cava for å ha et klart synsfelt i aorta.Ved hjelp av mikrodisseksjon tang og saks, begynne å løfte fettvev, og kutte så nær aorta som mulig. Fortsett dette nedover mediallinjen til alle aorta og lårarteriene er eksponert. I hjertet, fjern alt fettvevet som utsetter de tre grenene ved aortabuen.Fjern aortaroten fra venstre ventrikkel ved å sette inn mikro-disseksjon saks inn i venstre ventrikkel, og kutte muskelen rundt aorta. Når aorta er isolert og rengjort, bilde aorta ved hjelp av en nær-infrarød skanner for å visualisere vaskulær forkalkning. Ved hjelp av egendefinerte MATLAB skriptet, kvantifisere det totale signalet av kalsium tracer normalisert til den totale skannede aorta området.Direkte MATLAB til plasseringen av TIF-filene fra nær-infrarød skanning av aortaene, åpne de enkelte filene, og pakk ut pikselintensitetsverdiene fra TIF-filene. Velg hovedpulsåren med størst forkalkning som maksimumsskala på det fargekartlagte bildet. Når kommandoen, Hvor mange prøver er i bildet, vises i vinduet, skriv inn antall aorta i det gjeldende bildet, og velg hver aorta en etter en.Når en aorta er valgt, vil MATLAB lage binære bilder med en maske av det totale arealet og det forkalkede området av aorta. Verdiene fra disse maskerte bildene brukes deretter til å bestemme det totale forkalkede området, det totale arealet av aorta, prosentandelen som er positivt for forkalkning og gjennomsnittlig intensitet av det forkalkede området. Umiddelbart etter skanning av aortaene, basseng to til tre aorta for å gi en tilstrekkelig proteinkonsentrasjon.Inkuber to til tre samlede aortaer i 1,5 milliliter fordøyelsesløsning i to timer ved 37 grader Celsius. Samle løsningen og sentrifugen ved 1.000 g i 15 minutter for å fjerne celleavfall. Neste, for å fjerne mikrovesiklene, sentrifuge supernatanten igjen i 30 minutter ved 33.000 g.Samle inn og vurdere supernatanten for forkalkningspotensial. Etter å ha fjernet celleavfallet fra det kondisjonerte oppsamlede mediet ved sentrifugering, spinn den oppsamlede supernatanten ved 33.000 g i 30 minutter. Samle supernatanten og overfør den til et nytt rør.Deretter tilsettes 1% av 300 millimolar natriumdihydrogenfosfat til de ekstracellulære vesikelprøvene, og blander løsningen ved pipettering. Overfør 200 mikroliter av blandingsløsningen til en 96-brønnplate, og inkuber 96-brønnplaten i mikroplateleseren ved 37 grader Celsius. Still inn plateleseren til å registrere absorbansen ved en bølgelengde på 340 nanometer hvert minutt.Pipett 300 mikroliter kollagenoppløsning i hver brønn i et åtte-brønns kammerglass, og inkuber ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 72 timer. Etter inkubasjonen, tilsett 300 mikroliter DMEM som en kontroll i brønnene. Legg til 300 mikroliter av de ekstracellulære vesikkelmediumprøvene samlet tidligere til de resterende brønnene, og inkuber i seks dager, som vist tidligere.På den 10. dagen pipetter 2,5 mikroliter av OsteoSense- og DMEM-blandingen i hver brønn, og inkuberer i 24 timer. På slutten av inkubasjonen, bilde hydrogelene med filtre for OsteoSense-fluorescens gjennom bunnen av et dekselglasskammer ved hjelp av et omvendt mikroskop, eller fra toppen med et langt arbeidsavstandsmål. Vurder antall forkalkninger og forkalkningsstørrelsen og de innsamlede bildene ved hjelp av partikkelanalysealternativene som er tilgjengelige i ImageJ.Naviger deretter til Bilde, velg Juster og klikk Terskel for å binarisere bildene, slik at bare OsteoSense-signalet vises hvitt. Bruk deretter kommandoen Analyser, og klikk Analyser partikler for å hente informasjon for hver forkalkning i bildet. Bruk de samme terskelparameterne for konsekvens for hvert bilde som analyseres.Nær-infrarød optisk skanneravbildning av dissekerte aortaer viste et høyere OsteoSense-signal gjennom hovedpulsåren hos en mus med kronisk nyresykdom enn de to aortaene fra kontrollmusene. Det kondisjonerte medium oppnådd fra vaskulære glatte muskelceller dyrket i et pro-kalsifisk medium viste en høyere absorbans ved 340 nanometer enn kontrollmediet. Absorbansøkningen skjedde 1,5 ganger raskere i den prokalsifiske prøven sammenlignet med en kontrollprøve.Det betingede mediet fra celler dyrket under prokalsifiske forhold inneholdt mineralforekomster. Når mikrodissekere aorta, er det viktig å kutte fettet rundt aorta nøye. Du vil ha så mye av aorta som mulig å analysere, men dette kan være ganske kjedelig.Når EV er isolert, kan ytterligere tester, for eksempel en alkalisk fosfataseaktivitetsanalyse eller immunlegeme, fullføres. Disse testene vil videre vise mekanismene og proteinene som er tilstede i elbiler.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Mus Sperm Kryokonservering og Recovery bruke I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Syntese av Modified mRNA for Induksjon av Protein Expression i humane celler

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Måle Stivhet<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mus Aorta Bruke Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Micron skala Phenotyping teknikker av mais vaskulær pakker basert på X-ray Microcomputed tomografi

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Måling av energi Metabolism i Explanted netthinnen vev ekstracellulære Flux analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Bakterieflora analyse ved hjelp av to-trinns PCR og neste generasjons 16S rRNA Gene sekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

Introduksjon Analyse av E3 Ubiquitin Ligase-funksjonen

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...