Name: analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models
Uploaded: 2023-01-27T14:50:00
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Este trabalho foi apoiado por doações do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (1R01HL160740 e 5 T32GM132054-04) e da Fundação de Pesquisa do Coração da Flórida. Gostaríamos de agradecer a Kassandra Gomez por sua ajuda na síntese e imagem dos hidrogéis.

O trabalho in vivo foi aprovado e supervisionado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Internacional da Flórida e em conformidade com as diretrizes atuais dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). Para este protocolo, o procedimento não difere dependendo da tensão, peso, idade e sexo do rato. O tipo de calcificação que está sendo estudada, dietas e tratamentos podem alterar a duração do estudo e o peso do camundongo usado e podem ser dependentes de uma cepa espec...

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	<li>Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+mediators+of+cardiovascular+calcification.">Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).</li><li>Ho, C. Y., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+arterial+calcification:+an+overlooked+player+in+peripheral+arterial+disease.">Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).</li><li>Marinelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+arterial+media+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease.</a> Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).</li><li>Moe, S. M., Chen, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).</li><li>Mir, B., Goettsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+delivery+vehicles+of+specific+cellular+cargo.">Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo.</a> Cells. 9 (7), 1601 (2020).</li><li>Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification:+Current+controversies+and+novel+concepts.">Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).</li><li>New, S. E., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+vesicles+in+de+novo+mineralization:+An+additional+novel+mechanism+of+cardiovascular+calcification.">Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).</li><li>Aikawa, E., Hutcheson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , (2020).</li><li>Johnson, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-407-induced+murine+model+of+dose-controlled+hyperlipidemia+and+atherosclerosis:+A+review+of+findings+to+date.">The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).</li><li>Shobeiri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+animal+models+of+CKD:+A+review.">Vascular calcification in animal models of CKD: A review.</a> American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).</li><li>El-Abbadi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+feeding+induces+arterial+medial+calcification+in+uremic+mice:+role+of+serum+phosphorus,+fibroblast+growth+factor-23,+and+osteopontin.">Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin.</a> Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).</li><li>Veseli, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li><li>Chen, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase+2+accelerates+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease.</a> American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).</li><li>Wu, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+the+nucleational+core+of+matrix+vesicles.">Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).</li><li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques.">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).</li></ol>

Ao executar o protocolo, é importante observar as etapas críticas para a obtenção de resultados bem-sucedidos. Durante o isolamento da aorta murina, é vital que a perfusão seja realizada adequadamente. Ao injetar o PBS, deve-se tomar cuidado para não perfurar o ventrículo direito. Isso faria com que o líquido vazasse diretamente para fora do ventrículo e não circulasse pelos pulmões, deixando sangue dentro da aorta. Uma vez que a perfusão tenha sido conduzida adequadamente e a microdissecção tenha começad...

A calcificação é o preditor mais significativo de mortalidade e morbidade por doenças cardiovasculares1. A calcificação altera a mecânica da parede arterial devido ao acúmulo de minerais cálcio e fosfato2. Na aterosclerose, a calcificação pode exacerbar o estresse local e resultar em ruptura da placa, que é a principal causa de ataques cardíacos. A calcificação medial, muitas vezes decorrente de doença renal crônica, é mais difundida e leva a enrijecimento arterial significativo, disfunção e sobrecarga cardíaca 2,3. Atualmente, não existem opções terapêuticas para o tratamento ou prevenção da calcificação vascular.
As células musculares lisas vasculares (CMVS) adotam um fenótipo semelhante ao osteoblasto e liberam vesículas extracelulares calcificantes (EVs) que nucleam minerais nascentes, impulsionando a calcificação 4,5,6. Esse processo se assemelha à mineralização fisiológica dos osteoblastos no osso7. Embora o desfecho da mineralização seja semelhante na parede vascular e na matriz óssea, os mecanismos pelos quais os EVs calcificantes se originam diferem nos dois tecidos8. Existem muitos tipos de modelos que são usados para estudar a calcificação vascular. In vitro, os modelos de cultura celular imitam a transição osteogênica dos VSMCs e a subsequente formação mineral com meios especializados.
Ao estudar a calcificação in vivo, o modelo utilizado depende do tipo de calcificação que está sendo estudada. Modelos hiperlipidêmicos de camundongos são frequentemente utilizados para estudar a calcificação aterosclerótica, que parece mais focal dentro de placas ricas em lipídios9. Em contraste, a calcificação medial é mais difundida em toda a vasculatura e é frequentemente estudada usando modelos de doença renal crônica que empregam um regime de dieta rica em adenina para induzir insuficiência renal ou técnicas cirúrgicas para remover porções significativas dos rins10,11. Modelos agressivos de calcificação vascular têm utilizado uma combinação de modelos de doença renal hiperlipidêmica e crônica12. Este protocolo fornece um método para avaliar a calcificação vascular em aortas murinas para calcificação medial e aterosclerótica, extrair EVs da parede aórtica e observar o potencial de mineralização nos EVs obtidos a partir de modelos de cultura celular in vitro. Estudos futuros podem utilizar esses procedimentos em análises mecanicistas de calcificação vascular e para avaliar potenciais intervenções terapêuticas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155409PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 inch Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, High Concentraion, Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-8254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dish</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-90-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pan and Wax</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>DSPA01-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>DLx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)&#160;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B11229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680EX</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A4782602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multimode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 96-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>TPIN02-PK/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models

A doença cardiovascular é a principal causa de morte no mundo, e a calcificação vascular é o preditor mais significativo de eventos cardiovasculares; no entanto, atualmente não existem opções terapêuticas ou de tratamento para a calcificação vascular. A calcificação começa dentro de vesículas extracelulares especializadas (EVs), que servem como focos de nucleação pela agregação de íons cálcio e fosfato. Este protocolo descreve métodos para obtenção e avaliação da calcificação em aortas murinas e análise dos EVs extraídos associados. Primeiro, a dissecção macroscópica do rato é realizada para coletar quaisquer órgãos relevantes, como os rins, fígado e pulmões. Em seguida, a aorta murina é isolada e excisada da raiz aórtica para a artéria femoral. Duas a três aortas são então agrupadas e incubadas em uma solução digestiva antes de serem submetidas à ultracentrifugação para isolar os EVs de interesse. Em seguida, o potencial de mineralização dos EVs é determinado através da incubação em uma solução de alto teor de fosfato e medindo a absorvância da luz a um comprimento de onda de 340 nm. Finalmente, os hidrogéis de colágeno são usados para observar a formação mineral calcificada e a maturação produzida pelos EVs in vitro.

Uma vez extraídas as aortas, a imagem por meio de um scanner óptico infravermelho próximo mostra uma representação visual da aorta, bem como da calcificação vascular (Figura 1). Os valores de intensidade de pixel dentro da imagem fluorescente digitalizada representam a distribuição da calcificação e são mostrados aqui usando um mapa de calor colorido. Os métodos de quantificação incluem identificar um limiar positivo e relatar a área percentual da aorta com valores maiores qu...

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Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Este trabalho apresenta a metodologia para obtenção e avaliação da calcificação vascular pelo isolamento de aortas murinas seguidas da extração de vesículas extracelulares calcificadas para observação do potencial de mineralização.

Análise da calcificação vascular mediada por vesículas extracelulares utilizando modelos in vitro e in vivo

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Este protocolo fornece um método que pode ser usado para ajudar a avaliar e, no futuro, ajudar a desenvolver tratamentos para a calcificação vascular, que é o preditor mais significativo de doença cardiovascular. A capacidade de isolar EVs nos permite estudar mais profundamente os mecanismos que levam à calcificação vascular e à mudança fenotípica das células musculares lisas vasculares. Esta técnica fornece informações sobre os mecanismos moleculares iniciais da calcificação mediada por células musculares lisas vasculares.Entender isso permite que as opções terapêuticas sejam estudadas para o mecanismo compreendido. Quaisquer EVs de interesse podem ser estudados usando este método. Não é exclusivo das células musculares lisas vasculares, osteoblastos ou calcificação vascular.Depois de eutanasiar o rato, levante a pele usando uma pinça e faça uma incisão na linha média. Remova qualquer excesso de pele ou gordura. Em seguida, remova os órgãos reprodutivos, bexiga e gordura fora da linha média.Em seguida, mova os órgãos gastrointestinais para o lado direito e siga os intestinos na linha média. Uma vez encontrado, levante a linha média e excise o trato gastrointestinal até o estômago. Excise os rins, levantando-os para longe da linha média.Corte o mais próximo possível do rim. Remova o fígado levantando os lóbulos e cortando a linha média. Em seguida, perfundir o coração e a aorta injetando PBS frio no ventrículo direito usando uma seringa de 10 mililitros.Espere os pulmões inflarem e fique branco. Remova os pulmões e qualquer excesso de diafragma, ou caixa torácica. Para remover o osso, abra uma tesoura e coloque-a na região inferior do mouse acima da cauda.Corte para baixo, levante a coluna da pele e remova a gordura dos lados da linha média. Uma vez que a pele é destacada, excise a coluna vertebral e os órgãos intactos, cortando logo acima do coração. Coloque a coluna vertebral e os órgãos intactos em um copo de PBS no balde de gelo se transportar para um estereoscópio.Depois de mover a coluna vertebral e os órgãos para o prato de dissecação, preencha-o com PBS gelado e prenda a coluna vertebral e a caixa torácica usando agulhas. Sob o microscópio de dissecção, levante o coração cuidadosamente usando uma pinça e comece a cortar acima da coluna vertebral e abaixo da aorta. Continue até que o fundo da coluna vertebral seja atingido.Remova a coluna vertebral do prato dissecante e fixe o coração e qualquer gordura ou músculo estranho. Começando pela área logo abaixo do coração, identifique o esôfago, a veia cava e a aorta. Remova o esôfago e a veia cava para ter um campo visual claro da aorta.Usando a pinça de micro-dissecção e tesoura, comece a levantar o tecido adiposo e corte o mais próximo possível da aorta. Continue isso pela linha medial até que toda a aorta e as artérias femorais estejam expostas. No coração, remova todo o tecido adiposo expondo os três ramos no arco aórtico.Remova a raiz da aorta do ventrículo esquerdo inserindo a tesoura de microdissecção no ventrículo esquerdo e cortando o músculo ao redor da aorta. Uma vez que a aorta é isolada e limpa, a imagem da aorta usando um scanner infravermelho próximo para visualizar a calcificação vascular. Usando o script MATLAB personalizado, quantifique o sinal total do marcador de cálcio normalizado para a área total da aorta digitalizada.Direcione o MATLAB para o local dos arquivos TIF a partir da varredura de infravermelho próximo dos aortas, abra os arquivos individuais e extraia os valores de intensidade de pixel dos arquivos TIF. Selecione a aorta com a maior calcificação como a escala máxima na imagem mapeada a cores. Quando o comando, Quantos espécimes estão na imagem, aparecer na janela, insira o número de aortas na imagem atual e selecione cada aorta uma a uma.Uma vez que uma aorta é selecionada, o MATLAB criará imagens binárias com uma máscara da área total e da área calcificada da aorta. Os valores dessas imagens mascaradas são então usados para determinar a área total calcificada, a área total da aorta, a porcentagem de área positiva para calcificação e a intensidade média da área calcificada. Imediatamente após a varredura das aortas, agrupe duas a três aortas para produzir uma concentração suficiente de proteína.Incubar duas a três aortas agrupadas em 1,5 mililitros de solução digestiva por duas horas a 37 graus Celsius. Recolher a solução e centrifugar a 1 000 g durante 15 minutos para remover os detritos celulares. Em seguida, para remover as microvesículas, centrifugar o sobrenadante novamente por 30 minutos a 33.000 g.Coletar e avaliar o sobrenadante para o potencial de calcificação. Após a remoção dos detritos celulares do meio condicionado coletado por centrifugação, girar o sobrenadante coletado a 33.000 g por 30 minutos. Colete o sobrenadante e transfira-o para um novo tubo.Em seguida, adicione 1% de 300 milimolares de dihidrogenofosfato de sódio às amostras de vesículas extracelulares e misture a solução por pipetagem. Transfira 200 microlitros da solução de mistura para uma placa de 96 poços e incube a placa de 96 poços no leitor de microplacas a 37 graus Celsius. Configure o leitor de placas para registrar a absorvância em um comprimento de onda de 340 nanômetros a cada um minuto.Pipetar 300 microlitros da solução de colágeno em cada poço de um vidro de câmara de oito poços e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 72 horas. Após a incubação, adicione 300 microlitros de DMEM como controle nos poços. Adicionar 300 microlitros das amostras de meio vesicular extracelular coletadas previamente aos poços restantes e incubar por seis dias, como demonstrado anteriormente.No 10º dia, pipetar 2,5 microlitros da mistura OsteoSense e DMEM em cada poço e incubar por 24 horas. No final da incubação, imagine os hidrogéis com filtros para fluorescência OsteoSense através da parte inferior de uma câmara de vidro de cobertura usando um microscópio invertido, ou do topo com uma objetiva de longa distância de trabalho. Avalie o número de calcificações e o tamanho da calcificação e as imagens coletadas usando as opções de análise de partículas disponíveis no ImageJ.Em seguida, navegue até Imagem, selecione Ajustar e clique em Limiar para binarizizar as imagens, de modo que apenas o sinal OsteoSense apareça branco. Em seguida, use o comando Analisar e clique em Analisar partículas para obter informações para cada calcificação na imagem. Use os mesmos parâmetros de limite para consistência para cada imagem analisada.A imagem do scanner óptico infravermelho próximo das aortas dissecadas mostrou um sinal OsteoSense maior em toda a aorta de um rato com doença renal crônica do que as duas aortas de camundongos controle. O meio condicionado obtido a partir de células musculares lisas vasculares cultivadas em meio pró-calcifico apresentou maior absorvância a 340 nanômetros que o meio controle. O aumento da absorbância ocorreu 1,5 vezes mais rápido na amostra pró-calcífica em comparação com uma amostra controle.O meio condicionado de células cultivadas em condições pró-calcificas continha depósitos minerais. Ao micro-dissecar a aorta, é importante cortar a gordura ao redor da aorta com cuidado. Você quer o máximo possível da aorta para analisar, mas isso pode ser bastante tedioso.Uma vez que os EVs são isolados, testes adicionais, como um ensaio de atividade de fosfatase alcalina, ou imunocorpo podem ser concluídos. Esses testes mostrariam ainda mais os mecanismos e proteínas presentes nos VEs.

Research

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