Name: analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models
Uploaded: 2023-01-27T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från National Heart, Lung and Blood Institute of National Institutes of Health (NIH) (1R01HL160740 och 5 T32GM132054-04) och Florida Heart Research Foundation. Vi vill tacka Kassandra Gomez för hennes hjälp med att syntetisera och avbilda hydrogelerna.

In vivo-arbetet godkändes och övervakades av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Florida International University och överensstämde med gällande riktlinjer från National Institutes of Health (NIH). För detta protokoll skiljer sig proceduren inte beroende på musens belastning, vikt, ålder och kön. Den typ av förkalkning som studeras, dieter och behandlingar kan ändra studiens längd och vikten på musen som används och kan vara beroende av en specifik stam och kön hos musen som a...

<ol>
	<li>Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+mediators+of+cardiovascular+calcification.">Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).</li><li>Ho, C. Y., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+arterial+calcification:+an+overlooked+player+in+peripheral+arterial+disease.">Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).</li><li>Marinelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+arterial+media+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease.</a> Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).</li><li>Moe, S. M., Chen, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).</li><li>Mir, B., Goettsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+delivery+vehicles+of+specific+cellular+cargo.">Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo.</a> Cells. 9 (7), 1601 (2020).</li><li>Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification:+Current+controversies+and+novel+concepts.">Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).</li><li>New, S. E., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+vesicles+in+de+novo+mineralization:+An+additional+novel+mechanism+of+cardiovascular+calcification.">Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).</li><li>Aikawa, E., Hutcheson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , (2020).</li><li>Johnson, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-407-induced+murine+model+of+dose-controlled+hyperlipidemia+and+atherosclerosis:+A+review+of+findings+to+date.">The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).</li><li>Shobeiri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+animal+models+of+CKD:+A+review.">Vascular calcification in animal models of CKD: A review.</a> American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).</li><li>El-Abbadi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+feeding+induces+arterial+medial+calcification+in+uremic+mice:+role+of+serum+phosphorus,+fibroblast+growth+factor-23,+and+osteopontin.">Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin.</a> Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).</li><li>Veseli, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li><li>Chen, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase+2+accelerates+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease.</a> American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).</li><li>Wu, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+the+nucleational+core+of+matrix+vesicles.">Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).</li><li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques.">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).</li></ol>

När du utför protokollet är det viktigt att notera de kritiska stegen för att få framgångsrika resultat. Under isoleringen av murin aorta är det viktigt att perfusionen utförs korrekt. Vid injektion av PBS måste man vara försiktig så att man inte punkterar höger kammare. Detta skulle leda till att vätskan läcker direkt ut ur ventrikeln och misslyckas med att cirkulera genom lungorna och lämnar blod i aortan. När perfusionen har utförts ordentligt och mikrodissektion har börjat, måste all fett- och fett...

Förkalkning är den mest signifikanta prediktorn för kardiovaskulär sjukdomsdödlighet och sjuklighet1. Förkalkning förändrar artärväggmekaniken på grund av uppbyggnaden av kalcium- och fosfatmineraler2. Vid åderförkalkning kan förkalkning förvärra lokal stress och resultera i plackbrott, vilket är den främsta orsaken till hjärtinfarkt. Medial förkalkning - ofta till följd av kronisk njursjukdom - är mer utbredd och leder till betydande arteriell förstyvning, dysfunktion och hjärtöverbelastning 2,3. För närvarande finns det inga terapeutiska alternativ för behandling eller förebyggande av vaskulär förkalkning.
Vaskulära glattmuskelceller (VSMC) antar en osteoblastliknande fenotyp och släpper ut förkalkande extracellulära vesiklar (EV) som kärnar begynnande mineraler, vilket driver förkalkning 4,5,6. Denna process liknar den fysiologiska mineraliseringen av osteoblaster i ben7. Även om slutpunkten för mineralisering är likartad i kärlväggen och benmatrisen, skiljer sig mekanismerna genom vilka de förkalkande EV: erna härstammar i de två vävnaderna8. Det finns många typer av modeller som används för att studera vaskulär förkalkning. In vitro efterliknar cellodlingsmodeller den osteogena övergången av VSMC och efterföljande mineralbildning med specialiserade medier.
När man studerar förkalkning in vivo beror den modell som används på vilken typ av förkalkning som studeras. Hyperlipidemiska musmodeller används ofta för att studera aterosklerotisk förkalkning, vilket verkar mer fokalt inom lipidrika plack9. Däremot är medial förkalkning mer utbredd i hela vaskulaturen och studeras ofta med hjälp av kroniska njursjukdomsmodeller som använder en adeninrik dietregim för att inducera njursvikt eller kirurgiska tekniker för att ta bort betydande delar av njurarna10,11. Aggressiva modeller av vaskulär förkalkning har använt en kombination av både hyperlipidemiska och kroniska njursjukdomsmodeller12. Detta protokoll tillhandahåller en metod för att bedöma vaskulär förkalkning i murina aortor för både medial och aterosklerotisk förkalkning, extrahera EV från aortaväggen och observera mineraliseringspotentialen i EV erhållna från in vitro-cellodlingsmodeller. Framtida studier kan använda dessa procedurer i mekanistiska analyser av vaskulär förkalkning och för att bedöma potentiella terapeutiska ingrepp.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155409PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 inch Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, High Concentraion, Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-8254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dish</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-90-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pan and Wax</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>DSPA01-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>DLx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)&#160;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B11229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680EX</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A4782602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multimode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 96-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>TPIN02-PK/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models

Kardiovaskulär sjukdom är den främsta dödsorsaken i världen, och vaskulär förkalkning är den viktigaste prediktorn för kardiovaskulära händelser; Det finns dock för närvarande ingen behandling eller terapeutiska alternativ för vaskulär förkalkning. Förkalkning börjar inom specialiserade extracellulära vesiklar (EV), som fungerar som kärnbildande foci genom att aggregera kalcium- och fosfatjoner. Detta protokoll beskriver metoder för att erhålla och bedöma förkalkning i murina aortor och analysera tillhörande extraherade EV. Först utförs grov dissektion av musen för att samla in relevanta organ, såsom njurar, lever och lungor. Därefter isoleras murina aorta och skärs ut från aortaroten till lårbensartären. Två till tre aortor slås sedan samman och inkuberas i en matsmältningslösning innan de genomgår ultracentrifugering för att isolera EV: erna av intresse. Därefter bestäms mineraliseringspotentialen hos EV: erna genom inkubation i en högfosfatlösning och mätning av ljusabsorbansen vid en våglängd av 340 nm. Slutligen används kollagenhydrogeler för att observera den förkalkade mineralbildningen och mognaden som produceras av EV: erna in vitro.

När aortorna har extraherats visar avbildning med en nära infraröd optisk skanner en visuell representation av aortan såväl som vaskulär förkalkning (figur 1). Pixelintensitetsvärdena i den skannade fluorescerande bilden representerar fördelningen av förkalkning och visas här med en färgad värmekarta. Kvantifieringsmetoder innefattar identifiering av ett positivt tröskelvärde och rapportering av den procentuella arean av aortan med värden som är större än detta tröskelvä...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models at JoVE.com

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Detta dokument presenterar metoden för att erhålla och bedöma vaskulär förkalkning genom att isolera murina aortor följt av extraktion av förkalkade extracellulära vesiklar för att observera mineraliseringspotentialen.

Analys av extracellulär vesikelmedierad vaskulär förkalkning med användning av in vitro- och in vivo-modeller

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Detta protokoll ger en metod som kan användas för att bedöma och i framtiden hjälpa till att utveckla behandlingar för vaskulär förkalkning, vilket är den viktigaste prediktorn för hjärt-kärlsjukdom. Möjligheten att isolera EV gör det möjligt för oss att ytterligare studera mekanismerna som leder till vaskulär förkalkning och den fenotypiska förändringen av vaskulära glattmuskelceller. Denna teknik ger insikt i tidiga molekylära mekanismer för vaskulär glattmuskelcellmedierad förkalkning.Att förstå detta gör det möjligt att studera terapeutiska alternativ för den förstådda mekanismen. Alla elbilar av intresse kan studeras med hjälp av denna metod. Det är inte exklusivt för vaskulära glattmuskelceller, osteoblaster eller vaskulär förkalkning.Efter avlivning av musen, lyft huden med pincett och gör ett snitt längs mittlinjen. Ta bort överflödig hud eller fett. Ta sedan bort reproduktionsorganen, urinblåsan och fettet utanför mittlinjen.Flytta sedan mag-tarmorganen till höger och följ tarmarna i mittlinjen. När du hittat, lyft mittlinjen och punkta mag-tarmkanalen upp till magen. Punktskatta njurarna genom att lyfta dem bort från mittlinjen.Skär så nära njurarna som möjligt. Ta bort levern genom att lyfta loberna och skära bort från mittlinjen. Filtrera sedan hjärtat och aortan genom att injicera kall PBS i höger kammare med en 10-milliliter spruta.Vänta tills lungorna blåses upp och blir vita. Ta bort lungorna och eventuellt överskott av membran eller bröstkorg. För att ta bort benet, öppna en sax bred och placera dem i musens nedre region ovanför svansen.Skär nedåt, lyft ryggraden från huden och ta bort fettet från mittlinjens sidor. När huden är fristående, skära ryggraden och intakta organ genom att skära precis ovanför hjärtat. Placera ryggraden och intakta organ i en bägare PBS i ishinken om du transporterar till ett stereoskop.Efter att ha flyttat ryggraden och organen i dissekeringsskålen, fyll den med iskall PBS och stift ner ryggraden och bröstkorgen med nålar. Under dissektionsmikroskopet, lyft hjärtat försiktigt med pincett och börja skära ovanför ryggraden och under aortan. Fortsätt detta tills botten av ryggraden nås.Ta bort ryggraden från dissekeringsskålen och kläm fast hjärtat och eventuellt främmande fett eller muskler. Börja från området precis under hjärtat, identifiera matstrupen, vena cava och aorta. Ta bort matstrupen och vena cava för att få ett tydligt synfält av aortan.Använd mikrodissektionstången och saxen och börja lyfta fettvävnaden och skära så nära aortan som möjligt. Fortsätt detta längs mediallinjen tills alla aorta och lårbensartärerna exponeras. I hjärtat, ta bort all fettvävnad som exponerar de tre grenarna vid aortabågen.Ta bort aortaroten från vänster kammare genom att sätta in mikrodissektionsaxen i vänster kammare och skära muskeln som omger aortan. När aortan är isolerad och rengjord, avbilda aortan med hjälp av en nära infraröd skanner för att visualisera vaskulär förkalkning. Använd det anpassade MATLAB-skriptet, kvantifiera den totala signalen för kalciumspåraren normaliserad till det totala skannade aortaområdet.Rikta MATLAB till platsen för TIF-filerna från den nära infraröda skanningen av aortorna, öppna de enskilda filerna och extrahera pixelintensitetsvärdena från TIF-filerna. Välj aortan med störst förkalkning som skalmaximum på den färgmappade bilden. När kommandot, Hur många exemplar finns i bilden, visas i fönstret, mata in antalet aortor i den aktuella bilden och välj varje aorta en efter en.När en aorta har valts kommer MATLAB att skapa binära bilder med en mask av det totala området och det förkalkade området av aortan. Värdena från dessa maskerade bilder används sedan för att bestämma den totala förkalkade ytan, den totala ytan av aortan, den procentuella arealen positiv för förkalkning och medelintensiteten för det förkalkade området. Omedelbart efter skanning av aortorna, slå samman två till tre aortor för att ge en tillräcklig proteinkoncentration.Inkubera två till tre poolade aortor i 1,5 ml matsmältningslösning i två timmar vid 37 grader Celsius. Samla lösningen och centrifugera vid 1 000 g i 15 minuter för att avlägsna cellskräp. Därefter, för att avlägsna mikrovesiklarna, centrifugera supernatanten igen i 30 minuter vid 33 000 g.Samla in och bedöm supernatanten för förkalkningspotential. Efter avlägsnande av cellskräp från det konditionerade uppsamlade mediet genom centrifugering, snurra den uppsamlade supernatanten vid 33 000 g i 30 minuter. Samla supernatanten och överför den till ett nytt rör.Tillsätt sedan 1% 300 millimolar natriumdivätefosfat till de extracellulära vesikelproverna och blanda lösningen genom pipettering. Överför 200 mikroliter av blandningslösningen till en 96-brunnsplatta och inkubera 96-brunnsplattan i mikroplattläsaren vid 37 grader Celsius. Ställ in plattläsaren för att registrera absorbansen vid en våglängd på 340 nanometer varje minut.Pipettera 300 mikroliter av kollagenlösningen i varje brunn i ett kammarglas med åtta brunnar och inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 72 timmar. Efter inkubationen tillsätts 300 mikroliter DMEM som kontroll i brunnarna. Tillsätt 300 mikroliter av de extracellulära vesikelmedieproverna som samlats in tidigare till de återstående brunnarna och inkubera i sex dagar, som visats tidigare.På den 10: e dagen, pipettera 2,5 mikroliter av OsteoSense och DMEM-blandningen i varje brunn och inkubera i 24 timmar. I slutet av inkubationen, avbilda hydrogelerna med filter för OsteoSense-fluorescens genom botten av en täckglaskammare med hjälp av ett inverterat mikroskop eller från toppen med ett långt arbetsavståndsmål. Bedöm antalet förkalkningar och förkalkningsstorleken och de insamlade bilderna med hjälp av partikelanalysalternativen som finns i ImageJ.Navigera sedan till Bild, välj Justera och klicka på Tröskelvärde för att binarisera bilderna, så att endast OsteoSense-signalen visas vit. Använd sedan kommandot Analysera och klicka på kommandot Analysera partiklar för att få information för varje förkalkning i bilden. Använd samma tröskelvärdesparametrar för konsekvens för varje bild som analyseras.Nära infraröd optisk skanneravbildning av de dissekerade aortorna visade en högre OsteoSense-signal i hela aortan hos en mus med kronisk njursjukdom än de två aortorna från kontrollmöss. Det konditionerade mediet erhållet från vaskulära glattmuskelceller odlade i ett pro-kalkmedium visade en högre absorbans vid 340 nanometer än kontrollmediet. Absorbansökningen skedde 1,5 gånger snabbare i pro-calcific-provet jämfört med ett kontrollprov.Det konditionerade mediet från celler odlade i pro-kalkförhållanden innehöll mineralavlagringar. Vid mikrodissekering av aortan är det viktigt att skära fettet som omger aortan noggrant. Du vill ha så mycket av aortan som möjligt att analysera, men det kan vara ganska tråkigt.När EV är isolerade kan ytterligare tester, såsom en alkalisk fosfatasaktivitetsanalys eller immunkropp, slutföras. Dessa tester skulle ytterligare visa de mekanismer och proteiner som finns i EV.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analys av Schwann-astrocyternas interaktioner Använda In Vitro Analyser

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo och in vitro studier av Adapter-clathrin Interaktion

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualisering av MG53-medierad cellmembranet reparera med hjälp av In vivo Och In vitro System

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Mus Spermier Frysförvaring and Recovery med I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro Syntes av modifierade mRNA för induktion av proteinuttryck i humana celler

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Mätning av styvheten hos<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aorta Använda atomkraftsmikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Micron-skala fenotypning tekniker för majs kärlknippena baserat på röntgen Microcomputed tomografi

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Mätning av energimetabolism i explanterad retinala vävnaden med hjälp av extracellulära Flux analys

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Microbiota analys med två steg PCR och nästa generations 16S rRNA Gene sekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In vitro Analys av E3 Ubiquitin Ligase Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...