Name: analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models
Uploaded: 2023-01-27T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (1R01HL160740 ve 5 T32GM132054-04) ve Florida Kalp Araştırma Vakfı'ndan gelen hibelerle desteklenmiştir. Kassandra Gomez'e hidrojellerin sentezlenmesi ve görüntülenmesindeki yardımları için teşekkür ederiz.

In vivo çalışma, Florida Uluslararası Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve denetlenmiş ve mevcut Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) kurallarına uygun hale getirilmiştir. Bu protokol için prosedür, farenin gerginliğine, ağırlığına, yaşına ve cinsiyetine bağlı olarak farklılık göstermez. İncelenen kalsifikasyon türü, diyetler ve tedaviler, çalışmanın uzunluğunu ve kullanılan farenin ağırlığını değiştirebilir ...

<ol>
	<li>Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+mediators+of+cardiovascular+calcification.">Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).</li><li>Ho, C. Y., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+arterial+calcification:+an+overlooked+player+in+peripheral+arterial+disease.">Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).</li><li>Marinelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+arterial+media+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease.</a> Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).</li><li>Moe, S. M., Chen, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).</li><li>Mir, B., Goettsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+delivery+vehicles+of+specific+cellular+cargo.">Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo.</a> Cells. 9 (7), 1601 (2020).</li><li>Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification:+Current+controversies+and+novel+concepts.">Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).</li><li>New, S. E., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+vesicles+in+de+novo+mineralization:+An+additional+novel+mechanism+of+cardiovascular+calcification.">Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).</li><li>Aikawa, E., Hutcheson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , (2020).</li><li>Johnson, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-407-induced+murine+model+of+dose-controlled+hyperlipidemia+and+atherosclerosis:+A+review+of+findings+to+date.">The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).</li><li>Shobeiri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+animal+models+of+CKD:+A+review.">Vascular calcification in animal models of CKD: A review.</a> American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).</li><li>El-Abbadi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+feeding+induces+arterial+medial+calcification+in+uremic+mice:+role+of+serum+phosphorus,+fibroblast+growth+factor-23,+and+osteopontin.">Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin.</a> Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).</li><li>Veseli, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li><li>Chen, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase+2+accelerates+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease.</a> American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).</li><li>Wu, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+the+nucleational+core+of+matrix+vesicles.">Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).</li><li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques.">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).</li></ol>

Protokolü gerçekleştirirken, başarılı sonuçlar elde etmek için kritik adımları not etmek önemlidir. Murin aortun izolasyonu sırasında, perfüzyonun uygun şekilde yapılması hayati önem taşır. PBS'yi enjekte ederken, sağ ventrikülün delinmemesine dikkat edilmelidir. Bu, sıvının doğrudan ventrikülden sızmasına ve akciğerlerde dolaşamamasına ve aort içinde kan bırakmasına neden olur. Perfüzyon düzgün bir şekilde yapıldıktan ve mikrodiseksiyon başladıktan sonra, tamamlanmadan ve tara...

Kalsifikasyon kardiyovasküler hastalık mortalite ve morbiditesinin en önemli belirleyicisidir1. Kalsifikasyon, kalsiyum ve fosfat minerallerinin birikmesi nedeniyle arteriyel duvar mekaniğini değiştirir2. Aterosklerozda, kalsifikasyon lokal stresi şiddetlendirebilir ve kalp krizinin önde gelen nedeni olan plak rüptürüne neden olabilir. Genellikle kronik böbrek hastalığından kaynaklanan medial kalsifikasyon daha yaygındır ve önemli arteriyel sertleşme, disfonksiyon ve kardiyak aşırı yüklenmeye yol açar 2,3. Şu anda, vasküler kalsifikasyonun tedavisi veya önlenmesi için terapötik bir seçenek yoktur.
Vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler) osteoblast benzeri bir fenotip benimser ve yeni ortaya çıkan mineralleri çekirdeklendiren kalsifiye hücre dışı vezikülleri (EV'ler) serbest bırakır, böylece kalsifikasyonu yönlendirir 4,5,6. Bu süreç, kemik7'deki osteoblastların fizyolojik mineralizasyonuna benzer. Mineralizasyonun son noktası vasküler duvar ve kemik matrisinde benzer olmasına rağmen, kalsifiye edici EV'lerin ortaya çıktığı mekanizmalar iki dokuda farklılık gösterir8. Vasküler kalsifikasyonu incelemek için kullanılan birçok model türü vardır. In vitro, hücre kültürü modelleri, VSMC'lerin osteojenik geçişini ve ardından özel ortamlarla mineral oluşumunu taklit eder.
İn vivo kalsifikasyon çalışırken, kullanılan model çalışılan kalsifikasyon tipine bağlıdır. Hiperlipidemik fare modelleri, lipid bakımından zengin plaklarda daha fokal görünen aterosklerotik kalsifikasyonu incelemek için sıklıkla kullanılır9. Buna karşılık, medial kalsifikasyon vaskülatür boyunca daha yaygındır ve sıklıkla böbrek yetmezliğini indüklemek için adenden bakımından zengin bir diyet rejimi veya böbreklerin önemli kısımlarını çıkarmak için cerrahi teknikler kullanan kronik böbrek hastalığı modelleri kullanılarak incelenir10,11. Agresif vasküler kalsifikasyon modelleri, hem hiperlipidemik hem de kronik böbrek hastalığı modellerinin bir kombinasyonunu kullanmıştır12. Bu protokol, hem medial hem de aterosklerotik kalsifikasyon için murin aortlarda vasküler kalsifikasyonun değerlendirilmesi, aort duvarından EV'lerin çıkarılması ve in vitro hücre kültürü modellerinden elde edilen EV'lerdeki mineralizasyon potansiyelinin gözlemlenmesi için bir yöntem sağlar. Gelecekteki çalışmalar bu prosedürleri vasküler kalsifikasyonun mekanik analizlerinde ve potansiyel terapötik müdahaleleri değerlendirmek için kullanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155409PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 inch Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, High Concentraion, Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-8254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dish</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-90-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pan and Wax</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>DSPA01-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>DLx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)&#160;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B11229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680EX</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A4782602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multimode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 96-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>TPIN02-PK/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models

Kardiyovasküler hastalık dünyada önde gelen ölüm nedenidir ve vasküler kalsifikasyon kardiyovasküler olayların en önemli belirleyicisidir; Bununla birlikte, şu anda vasküler kalsifikasyon için herhangi bir tedavi veya terapötik seçenek bulunmamaktadır. Kalsifikasyon, kalsiyum ve fosfat iyonlarını toplayarak çekirdeklendirici odaklar olarak işlev gören özel hücre dışı veziküller (EV'ler) içinde başlar. Bu protokol, murin aortlarda kalsifikasyonun elde edilmesi ve değerlendirilmesi ve ilişkili ekstrakte edilen EV'lerin analizi için yöntemleri açıklamaktadır. İlk olarak, farenin brüt diseksiyonu, böbrekler, karaciğer ve akciğerler gibi ilgili organları toplamak için gerçekleştirilir. Daha sonra murin aort izole edilir ve aort kökünden femoral artere eksize edilir. İki ila üç aort daha sonra, ilgilenilen EV'leri izole etmek için ultrasantrifüjlemeye tabi tutulmadan önce bir sindirim çözeltisinde toplanır ve inkübe edilir. Daha sonra, EV'lerin mineralizasyon potansiyeli, yüksek fosfatlı bir çözeltide inkübasyon ve ışık emiciliğinin 340 nm dalga boyunda ölçülmesi yoluyla belirlenir. Son olarak, kollajen hidrojelleri, EV'ler tarafından in vitro olarak üretilen kalsifiye mineral oluşumunu ve olgunlaşmasını gözlemlemek için kullanılır.

Aortlar çıkarıldıktan sonra, yakın kızılötesi optik tarayıcı kullanılarak yapılan görüntüleme, aortun yanı sıra vasküler kalsifikasyonun görsel bir temsilini gösterir (Şekil 1). Taranan floresan görüntüdeki piksel yoğunluğu değerleri, kireçlenmenin dağılımını temsil eder ve burada renkli bir ısı haritası kullanılarak gösterilir. Niceleme yöntemleri, pozitif bir eşik belirlemeyi ve aortun yüzde alanını bu eşik değerinden daha büyük değerlerle ra...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models at JoVE.com

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Bu yazıda, murin aortlarının izole edilmesi, ardından mineralizasyon potansiyelini gözlemlemek için kalsifiye hücre dışı veziküllerin ekstraksiyonu ile vasküler kalsifikasyonun elde edilmesi ve değerlendirilmesi için metodoloji sunulmaktadır.

Hücre Dışı Vezikül Aracılı Vasküler Kalsifikasyonun In Vitro ve In Vivo Modeller Kullanılarak Analizi

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Bu protokol, kardiyovasküler hastalığın en önemli belirleyicisi olan vasküler kalsifikasyon için tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olmak ve gelecekte değerlendirmek için kullanılabilecek bir yöntem sağlar. EV'leri izole etme yeteneği, vasküler kalsifikasyona yol açan mekanizmaları ve vasküler düz kas hücrelerinin fenotipik değişimini daha fazla incelememizi sağlar. Bu teknik, vasküler düz kas hücresi aracılı kalsifikasyonun erken moleküler mekanizmaları hakkında fikir vermektedir.Bunu anlamak, anlaşılan mekanizma için terapötik seçeneklerin incelenmesini sağlar. İlgilenilen herhangi bir EV, bu yöntem kullanılarak incelenebilir. Vasküler düz kas hücresine, osteoblastlara veya vasküler kalsifikasyona özgü değildir.Fareyi ötenazi yaptıktan sonra, cımbız kullanarak cildi kaldırın ve orta çizgiden aşağı doğru bir kesi yapın. Fazla cildi veya yağları çıkarın. Daha sonra üreme organlarını, mesaneyi ve orta hattın dışındaki yağları çıkarın.Daha sonra gastrointestinal organları sağ tarafa taşıyın ve orta hattaki bağırsakları takip edin. Bulunduktan sonra, orta hattı kaldırın ve gastrointestinal sistemi mideye kadar tüketin. Böbrekleri orta hattan uzaklaştırarak tüketin.Böbreğe mümkün olduğunca yakın kesin. Lobları kaldırarak ve orta hattan keserek karaciğeri çıkarın. Daha sonra 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak sağ ventriküle soğuk PBS enjekte ederek kalbi ve aortu perfüze edin.Akciğerlerin şişmesini ve beyaza dönmesini bekleyin. Akciğerleri ve fazla diyaframı veya göğüs kafesini çıkarın. Kemiği çıkarmak için, bir çift makas genişliğinde açın ve bunları kuyruğun üzerindeki farenin alt bölgesine yerleştirin.Aşağı doğru kesin, omurgayı deriden kaldırın ve orta hattın yanlarındaki yağı çıkarın. Cilt ayrıldıktan sonra, kalbin hemen üzerinde keserek omurgayı ve sağlam organları çıkarın. Omurgayı ve bozulmamış organları, bir stereoskopa taşınıyorsa, buz kovasındaki bir PBS kabına yerleştirin.Omurgayı ve organları diseksiyon kabına taşıdıktan sonra, buz gibi PBS ile doldurun ve iğneleri kullanarak omurgayı ve göğüs kafesini sabitleyin. Diseksiyon mikroskobu altında, cımbız kullanarak kalbi dikkatlice kaldırın ve omurganın üstünde ve aortun altında kesmeye başlayın. Omurganın dibine ulaşana kadar buna devam edin.Omurgayı diseksiyon kabından çıkarın ve kalbi ve herhangi bir yabancı yağ veya kası sabitleyin. Kalbin hemen altındaki bölgeden başlayarak, yemek borusu, vena kava ve aortu tanımlayın. Aortun net bir görme alanına sahip olmak için yemek borusunu ve vena kavayı çıkarın.Mikro diseksiyon forseps ve makas kullanarak, yağ dokusunu kaldırmaya ve aort mümkün olduğunca yakın kesmeye başlayın. Tüm aort ve femoral arterler açığa çıkana kadar medial çizgiden devam edin. Kalpte, aort arkındaki üç dalı açığa çıkaran tüm yağ dokusunu çıkarın.Mikro diseksiyon makasını sol ventriküle sokarak ve aortu çevreleyen kası keserek aort kökünü sol ventrikülden çıkarın. Aort izole edildikten ve temizlendikten sonra, vasküler kalsifikasyonu görselleştirmek için yakın kızılötesi bir tarayıcı kullanarak aortu görüntüleyin. Özel MATLAB betiğini kullanarak, taranan toplam aort alanına normalleştirilmiş kalsiyum izleyicinin toplam sinyalini sayın.MATLAB'ı, aortların yakın kızılötesi taramasından TIF dosyalarının konumuna yönlendirin, tek tek dosyaları açın ve TIF dosyalarından piksel yoğunluğu değerlerini ayıklayın. Renk eşlemeli görüntüde maksimum ölçek olarak en büyük kireçlenmeye sahip aortu seçin. Pencerede kaç örnek var, komutu göründüğünde, geçerli görüntüdeki aort sayısını girin ve her bir aortu tek tek seçin.Bir aort seçildikten sonra, MATLAB toplam alanın ve aortun kalsifiye alanının maskesiyle ikili görüntüler oluşturacaktır. Bu maskelenmiş görüntülerden elde edilen değerler daha sonra toplam kalsifiye alanı, aortun toplam alanını, kalsifikasyon için pozitif olan yüzde alanını ve kalsifiye alanın ortalama yoğunluğunu belirlemek için kullanılır. Aortları taradıktan hemen sonra, yeterli protein konsantrasyonu elde etmek için iki ila üç aort toplayın.İki ila üç havuzlanmış aortu 1.5 mililitre sindirim çözeltisinde 37 santigrat derecede iki saat boyunca inkübe edin. Çözeltiyi toplayın ve hücre kalıntılarını çıkarmak için 15 dakika boyunca 1.000 g'da santrifüj yapın. Daha sonra, mikro-parçacıkları çıkarmak için, süpernatantı 33.000 g'da 30 dakika boyunca tekrar santrifüj edin.Kalsifikasyon potansiyeli için süpernatantı toplayın ve değerlendirin. Hücre kalıntılarını santrifüjleme ile şartlandırılmış toplanan ortamdan çıkardıktan sonra, toplanan süpernatantı 30 dakika boyunca 33.000 g'da döndürün. Süpernatantı toplayın ve yeni bir tüpe aktarın.Daha sonra hücre dışı vezikül örneklerine 300 milimolar sodyum dihidrojen fosfatın% 1'ini ekleyin ve çözeltiyi pipetleme ile karıştırın. Karışım çözeltisinin 200 mikrolitresini 96 delikli bir plakaya aktarın ve 96 delikli plakayı mikroplaka okuyucuda 37 santigrat derecede inkübe edin. Plaka okuyucuyu, absorbansı her bir dakikada bir 340 nanometre dalga boyunda kaydedecek şekilde ayarlayın.Sekiz delikli bir hazneli camın her bir kuyucuğuna 300 mikrolitre kollajen çözeltisi pipet yerleştirin ve 72 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Kuluçkadan sonra, kuyucuklara kontrol olarak 300 mikrolitre DMEM ekleyin. Daha önce toplanan hücre dışı vezikül orta örneklerinden 300 mikrolitreyi kalan kuyucuklara ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi altı gün boyunca inkübe edin.10. günde, OsteoSense ve DMEM'in 2.5 mikrolitrelik pipeti, her bir kuyucuğa karışır ve 24 saat boyunca inkübe edilir. Kuluçkanın sonunda, hidrojelleri OsteoSense floresan filtreli filtrelerle, ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak bir kapak camı odasının altından veya uzun bir çalışma mesafesi hedefiyle üstten görüntüleyin. ImageJ'de bulunan parçacık analizi seçeneklerini kullanarak kireçlenme sayısını, kireçlenme boyutunu ve toplanan görüntüleri değerlendirin.Ardından Görüntü'ye gidin, Ayarla'yı seçin ve görüntüleri yalnızca OsteoSense sinyali beyaz görünecek şekilde ikili hale getirmek için Eşik'i tıklatın. Ardından Analiz Et'i kullanın ve görüntüdeki her kireçlenme için bilgi edinmek üzere Parçacıkları Analiz Et komutunu tıklatın. Analiz edilen her görüntünün tutarlılığı için aynı eşik parametrelerini kullanın.Diseke edilmiş aortların yakın kızılötesi optik tarayıcı görüntülemesi, kronik böbrek hastalığı olan bir farenin aortu boyunca, kontrol farelerinden gelen iki aorttan daha yüksek bir OsteoSense sinyali gösterdi. Pro-kalsifik bir ortamda kültürlenmiş vasküler düz kas hücrelerinden elde edilen şartlandırılmış ortam, kontrol ortamından 340 nanometrede daha yüksek bir absorbans göstermiştir. Absorbans artışı, pro-kalsifik numunede bir kontrol numunesine kıyasla 1,5 kat daha hızlı gerçekleşti.Pro-kalsifik koşullarda kültürlenen hücrelerden elde edilen şartlandırılmış ortam, mineral birikintileri içeriyordu. Aortu mikro diseke ederken, aortu çevreleyen yağın dikkatlice kesilmesi önemlidir. Aortun mümkün olduğunca çoğunu analiz etmek istersiniz, ancak bu oldukça sıkıcı olabilir.EV'ler izole edildikten sonra, alkali fosfataz aktivite testi veya immün cisim gibi ek testler tamamlanabilir. Bu testler ayrıca EV'lerde bulunan mekanizmaları ve proteinleri gösterecektir.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann-astrosit Etkileşimleri Analizi In Vitro Tahliller

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo ve in vitro Adaptör-clathrin Etkileşim Çalışmaları

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

MG53-aracılı Hücre Zarı Tamiri Görselleştirme In vivo Ve In vitro Sistemleri

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

I · Cryo Kit kullanarak Fare Sperm Kriyoprezervasyon ve Kurtarma

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro sentezi insan hücrelerinde protein sentezlenmesinin uyarımından için mRNA&#39;nın Değiştirilmiş

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

X-ışını Microcomputed tomografi üzerinde dayalı Mısır Vaskular demetleri mikron çaplı fenotipleme teknikleri

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Explanted Retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro E3 Ubiquitin Ligase fonksiyonunun analizi

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...