Name: antibody uptake assay for tracking notch/delta endocytosis during the asymmetric division of zebrafish radial glia progenitors
Uploaded: 2023-01-20T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody Uptake Assay for Tracking Notch/Delta Endocytosis During the Asymmetric Division of Zebrafish Radial Glia Progenitors at JoVE.com

Projektet stöddes av NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation och Chan Zuckerberg Biohub.

Vi har använt AB wild type line och transgenlinjen Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] för studien. Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of California, San Francisco, USA (godkännandenummer: AN179000).
1. Beredning av zebrafiskembryon
<ol><li>Ställ in fiskkorsningstankar på eftermiddagen före 17:00, med en kvinnlig vildtypfisk och en manlig Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] fisk genom att använda avdelare för a...

<ol>
	<li>Baonza, A., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+directly+controls+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+disc.">Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).</li><li>Chitnis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).</li><li>Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+trafficking+during+mitosis+and+notch-dependent+asymmetric+division.">Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division.</a> Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).</li><li>Le Borgne, R., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling:+endocytosis+makes+delta+signal+better.">Notch signaling: endocytosis makes delta signal better.</a> Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).</li><li>Chapman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+endocytosis+is+induced+by+ligand+and+is+required+for+signal+transduction.">Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).</li><li>Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-1+signalling+requires+ligand-induced+proteolytic+release+of+intracellular+domain.">Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain.</a> Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).</li><li>Coumailleau, F., F&#252;rthauer, M., Knoblich, J. A., Gonz&#225;lez-Gait&#225;n, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+Delta+and+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division.">Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division.</a> Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).</li><li>Derivery, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+endosome+dynamics+by+spindle+asymmetry+during+asymmetric+cell+division.">Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division.</a> Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).</li><li>Matsuda, M., Chitnis, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+Notch+determines+endocytosis+of+specific+Delta+ligands+in+zebrafish+neural+tissue.">Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue.</a> Development. 136 (2), 197-206 (2009).</li><li>Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., F&#252;rthauer, M., Gonz&#225;lez-Gait&#225;n, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division+in+the+spinal+cord.">Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).</li><li>Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -. Y., Chitnis, A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intralineage+directional+Notch+signaling+regulates+self-renewal+and+differentiation+of+asymmetrically+dividing+radial+glia.">Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia.</a> Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+endosome+dynamics+engage+cytoplasmic+Par-3+that+recruits+dynein+during+asymmetric+cell+division.">Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division.</a> Science Advances. 7 (24), (2021).</li><li>Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+analysis+for+cryosectioned+and+immunostained+tissue+samples+with+or+without+label+retention+expansion+microscopy+(LR-ExM)+by+JACoP.">Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP.</a> Bio-Protocol. 12 (5), 4336 (2022).</li><li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+brain+ventricle+injection.">Zebrafish brain ventricle injection.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1218 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+the+injection+volume+for+microinjection+of+Xenopus+oocytes+and+embryos.">Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+&#181;Manager.">Computer control of microscopes using &#181;Manager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Lukinavi&#269;ius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+probes+for+multicolor+imaging+in+living+cells.">Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).</li></ol>

Vi har utvecklat en antikroppsupptagsanalys för märkning och avbildning av endosomal Notch / Delta-handel i zebrafisk radiella glia-förfäder med hög effektivitet. Jämfört med tidigare metoder som använts för att spåra märkt anti-DeltaD-antikropp i Drosophila SOP-celler7,8, använde vår metod mikroinjektion istället för inkubation av prover i den konjugerade antikroppen. Fluorescerande konjugerade anti-DLD-antikroppar mikroinjicerades i bakhjärnans ...

Notch-signalering styr cellens ödesbeslut och mönster under utvecklingen i metazoans1, och nyligen genomförda studier har visat att Notch-signalering vid stamcellsdelning huvudsakligen beror på endocytisk handel 2,3. Endocytosed Notch / Delta kan aktivera Notch-signalering i kärnan och förbättra transkriptionen av Notch-målgener 4,5,6. Riktad Notch/Delta endosomal trafficking observerades först i Drosophila sensoriska organprekursorceller (SOP) under dess asymmetriska celldelning (ACD), vilket resulterade i en högre Notch-signaleringsaktivitet i pIIa än i pIIb 7,8. Antikroppsupptagsanalyser med anti-Delta- och anti-Notch-antikroppar har tillämpats för att övervaka den endocytiska processen i mitotiska SOP-celler. Notch/DeltaD-endosomer rör sig tillsammans med ett kinesinmotoriskt protein till den centrala spindeln under cytokinese och translokeras asymmetriskt in i pIIa-cellen på grund av den asymmetriska centralspindelns antiparallella uppsättning i det sista ögonblicket av celldelning 3,8. Dessa studier har belyst de molekylära mekanismerna som reglerar asymmetrisk delning i Drosophila SOP-celler, men det är oklart om liknande endocytiska processer förekommer hos ryggradsdjur radiella glia progenitorer (RGP).
Dessutom är de molekylära mekanismerna som reglerar asymmetrisk Notch / DeltaD-signalering under ryggradsdjur RGP-delning inte väl förstådda. I zebrafisk har det rapporterats att interaktionen mellan Notch och Delta underlättar endocytosen hos DeltaD-liganden9. Det är okänt om DeltaD-endocytos kan påverka cellens öde val av dotterceller i den utvecklande ryggradsdjurhjärnan. Nya studier visar att injicera fluorescerande konjugerade anti-DeltaD-antikroppar i neuralröret kan märka Sara-endosomer specifikt i neuroepitelceller, och anti-DeltaD innehållande Sara-endosomer segregerar företrädesvis till prolifererande dotterceller10. Det har föreslagits att Notch-signalering från endosomerna skulle kunna reglera dottercellens öde. Tidigare resultat har visat att de flesta zebrafisk RGP-celler i den utvecklande framhjärnan genomgår ACD, och dottercellens ödesbestämning är beroende av intralineage Notch / DeltaD-signalering11. För att belysa karaktären av intralineage Notch / DeltaD-signalering i zebrafisk RGPs har vi utvecklat anti-DeltaD-antikroppsupptagsanalysen i zebrafiskens utvecklande hjärna. Med hjälp av detta protokoll har vi framgångsrikt utfört livemärkning och avbildning av DeltaD-endocytisk handel i mitotiska RGP.
Den fluorescerande märkta anti-DeltaD-antikroppen internaliseras effektivt i RGP: erna längs framhjärnkammaren. Det har i hög grad underlättat upptäckten av riktad handel med DeltaD-endosomer i de asymmetriskt delande RGP: erna12,13. Jämfört med tidigare antikroppsupptagsprotokoll som utvecklats för Drosophila notum-kulturer och zebrafiskryggmärgen 10, har detta protokoll uppnått långvarig och mycket effektiv anti-DeltaD-märkning i hjärnventrikelcellskiktet, specifikt med mindre än10 nL mikroinjicerad antikroppsblandning. Injektionen av bakhjärnans ventrikel är mycket lämplig för att applicera antikroppsupptagsanalysen i den utvecklande hjärnan, eftersom bakhjärnans ventrikel är väl expanderad i zebrafiskembryon och fylld med cerebrospinalvätska i tidigt utvecklingsstadium14. Genom att injicera antikroppsblandningen i bakhjärnans kammare utan att skada några viktiga utvecklingsvävnader har protokollet minimerat eventuella skador på avbildningszonen i framhjärnan så mycket som möjligt. Den reducerade dosen av den injicerade primära antikroppen har också undvikit potentiella biverkningar av att störa endogen Delta-Notch-signalering in vivo. Detta protokoll kan enkelt kombineras med andra farmakologiska eller genetiska störningar, som används i olika utvecklingsstadier, och möjligen anpassas till den vuxna hjärnan såväl som humana pluripotenta stamcellshärledda 2D/3D-hjärnorganoider. Sammantaget har protokollet gjort det möjligt att förstå hur och när Notch-signalasymmetri etableras under ACD. Den största utmaningen för ett framgångsrikt genomförande av detta protokoll är att uppnå exakt leverans av lämpliga koncentrationer av antikroppen baserat på specifika experimentella förhållanden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm glass bottom culture dish&#160;</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35GC-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air pressure injector&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse-IgG-Atto647N&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.2H2O&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B120F-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield</td>
			<td>Nikin</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nikon&#160;Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Medical Tweezers Style 5</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>72877-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming-Brown P897 puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulators</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>WPI M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Dld&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB_1268496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG blocking buffer from Zenon</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Z25008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 2000&#160;&#160;</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPureTM low melting point agarose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody uptake assay for tracking notch/delta endocytosis during the asymmetric division of zebrafish radial glia progenitors

Asymmetrisk celldelning (ACD), som producerar två dotterceller av olika öden, är grundläggande för att generera cellulär mångfald. I utvecklingsorganen hos både ryggradslösa djur och ryggradsdjur genererar asymmetriskt delande förfäder en Notchhej självförnyande och en Notchlo differentierande dotter. I den embryonala zebrafiskhjärnan genomgår radiella glia-progenitorer (RGP) - de viktigaste neurala stamcellerna hos ryggradsdjur - mestadels ACD för att föda en RGP och en differentierande neuron. Den optiska klarheten och lättillgängligheten hos zebrafiskembryon gör dem idealiska för in vivo-time-lapse-avbildning för att direkt visualisera hur och när asymmetrin i Notch-signalering etableras under ACD. Nya studier har visat att dynamisk endocytos av Notch-liganden DeltaD spelar en avgörande roll vid bestämning av cellens öde under ACD, och processen regleras av den evolutionärt bevarade polaritetsregulatorn Par-3 (även känd som Pard3) och dyneinmotorkomplexet. För att visualisera in vivo-handelsmönstren för Notch-signalendosomer i mitotiska RGP har vi utvecklat denna antikroppsupptagsanalys. Med hjälp av analysen har vi upptäckt dynamiken hos DeltaD-innehållande endosomer under RGP-delning.

I figur 2A visade embryon injicerade med Atto647N, utan bindning till den primära antikroppen, bakgrundsfluorescens i hjärnventrikeln. Mycket få uppslukade fluorescerande partiklar kan observeras i cellerna. De anti-Dld-Atto647N-injicerade zebrafiskembryona visade stora mängder internaliserade fluorescerande partiklar i de flesta celler i den utvecklande framhjärnan (figur 2A, höger panel). Efter att ha zoomat in för att fokusera på mitotiska RGP, som vi...

Watch this Scientific Journal Video about Antibody Uptake Assay for Tracking Notch/Delta Endocytosis During the Asymmetric Division of Zebrafish Radial Glia Progenitors at JoVE.com

Antibody Uptake Assay for Tracking Notch/Delta Endocytosis During the Asymmetric Division of Zebrafish Radial Glia Progenitors

Detta arbete utvecklar en antikroppsupptagsanalys för avbildning av intra-lineage Notch / DeltaD-signalering i delande radiella glia-förfäder till den embryonala zebrafiskhjärnan.

Antikroppsupptagsanalys för spårning av hack/delta-endocytos under den asymmetriska delningen av zebrafiskens radiella glia-förfäder

Asymmetric cell division (ACD), which produces two daughter cells of different fates, is fundamental for generating cellular diversity. In the developing ...

Notch-signalering styr sulfatbeslut och mönster under utveckling hos metazoaner. Vi har utvecklat en antikroppsupptagningsanalys för att märka hackliganden delta-D och avbilda dess endocytiska handel med radiella glia-förfäder i den utvecklande zebrafiskens framhjärna. Zebrafiskens dolda hjärnkammarinjektion möjliggör selektivt upptag av Anti-Dld-Atto-647N av myototiska radiella glia-förfäder som kantar hjärnkamrarna under utveckling med hög effektivitet och långvariga effekter.Detta protokoll kan enkelt kombineras med andra farmakologiska eller genetiska störningar som används i olika utvecklingsstadier och eventuellt anpassas till den vuxna hjärnan såväl som humana pluripotenta stamcellshärledda 2D- eller 3D-hjärnorganoider. Efter att ha genererat de befruktade embryon och inkuberat dem i 18 till 20 timmar, ta bort dem från inkubatorn. Observera dem under ett epifluorescensmikroskop med vitt ljus först vid en 20 gånger förstoring.Kassera döda embryon som verkar grumliga eller spruckna under mikroskopet med en glaspipett. Slå sedan på lysröret och välj mikroskopets RFP-filterinställning. Välj embryon med stark röd fluorescens och överför dem till en ny maträtt med äggvatten.Dekorionera nu embryon manuellt med två fina pincett under vitt ljus. Håll korionen med ett par pincett och gör en tår i korionen med de andra pincetterna. Öppna tåran försiktigt med pincetten och gör den tillräckligt stor för att embryot ska passera genom att försiktigt trycka på embryot med spetsarna på de andra tångarna.Överför de dekorionerade embryona till en ny petriskål med färskt embryonalt medium för snabb sköljning före mikroinjektion. Efter att ha dragit fina injektionsnålar på en avdragare, öppna nålspetsen med pincett under ett stereodissektionsmikroskop. Gör spetsens diameter cirka 10 mikrometer och avsmalningsvinkeln cirka 30 grader.Blanda nu 0,5 mikroliter av anti-DLD-antikroppen med två mikroliter av antimusen L G Atto-647N-antikroppen genom att pipettera fem till 10 gånger för att konjugera dem och inkubera vid rumstemperatur i minst 30 minuter. Vid slutet av inkubationen tillsätts 2,5 mikroliter blockerande buffert och 0,5 mikroliter 0,5% fenolrött till antikroppsblandningen och blandas genom pipettering för att blockera eventuella okonjugerade antikroppar kvar i blandningen. Förbered sedan 1% låg smältpunkt agaros i embryomediet.Värm den agaroshaltiga blandningen vid 70 grader Celsius tills blandningen blir transparent. Efter alikvotering av agaroslösningen, förvara dem i ett värmeblock vid 40 grader Celsius. Skölj embryot i röret som innehåller agaros med 1% låg smältpunkt i tre sekunder.Placera embryot på ett inverterat petriskållock av plast med individuella agarosdroppar för att montera varje embryo separat. Lägg embryona platt i sidled i agarosen och behåll denna position tills agarosen har stelnat vid rumstemperatur. Täck alla monterade embryon i agarosen med äggmedium.Sätt de inbäddade embryon under stereomikroskopet och täck agarosen med äggvatten. Ställ in lufttrycksinjektorn med mikromanipulatorer och placera dem nära mikroskopen. Använd stålgasflaskan som innehåller gasformigt kväve under högt tryck som luftresurs.När embryon har monterats i agarosen, öppna gasventilen. När du använder mikroinjektorns främre fyllningsmodul, frontladda den förberedda glasnålen med två mikroliter antikroppsblandning på mikromanipulatorn. Ställ nu in ingångstrycket till 80 till 90 pund per kvadrattum och injektionstrycket till 20 pund per kvadrattum.Kalibrera injektionsvolymen med en mikrometer under mikroskopet. Ställ in inställningstidens varaktighet enligt nålöppningens storlek från 10 till 120 millisekunder. Tryck på paddeln för att leverera varje injektionspuls och justera injektionsvolymen för varje leverans till fyra till fem nanoliter.Stick sedan spetsen på mikroinjektionsnålen genom bakhjärnans dorsala takplatta, bakom rondimere noll-ett gångjärnspunkt och injicera cirka 10 nanoliter antikroppsblandning utan att träffa hjärnvävnaden. Observerade flödet av röda vätskor i hjärnkammaren. Efter injektion, ta bort nålspetsen från embryot snabbt genom att vrida på vredet på mikromanipulatorn.För en lyckad injektion förblir det röda färgämnet i den injicerade blandningen stabilt i hjärnventrikeln utan att läcka in i den omgivna agarosen. Flytta monteringsplattan under mikroskopet för att lokalisera ett annat monterat embryo i en lämplig position för upprepningar. Efter att ha injicerat sex till åtta embryon, skala agarosen med en mikrokirurgisk kniv för att frigöra embryon från den inbäddade agarosen.Överför de mikroinjicerade embryona till en ny skål med 30 ml embryomedium och placera dem vid rumstemperatur för nästa steg. Efter 30 minuter överför de valda embryon till 10 ml embryomedium. För att montera embryon, förbered agaros med 0,8% låg smältpunkt som innehåller samma koncentration av tricane i röret.Använd en glaspipett för att fördjupa de injicerade embryon i den varma agarosen i tre sekunder. Ta sedan omedelbart bort embryon från agarosen med samma glaspipett och placera embryon i mitten av 35 millimeter glasbottenodlingsskålar med en droppe agaros från röret. Orientera embryona försiktigt med en fibersond eller laddningsspets för att hålla den dorsala sidan av den embryonala hjärnan så nära glasbotten som möjligt.Vrid embryopositionen försiktigt för att förlänga embryot utan att krulla när agarosen stelnar gradvis. Kontrollera sedan embryopositionen genom att vända glasbottenskålen. Se till att hela dorsala framhjärnan med de korrekt monterade embryona kan ses under mikroskopet.Tillsätt två till tre milliliter 28,5 grader Celsius förvärmt embryonalt medium innehållande tricane för att täcka embryot. Placera skålen ordentligt på det temperaturkontrollerade steget i konfokalmikroskopet och justera temperaturen i bildkammaren till 28,5 grader Celsius. Embryot är nu redo för avbildning.De Atto-647N-injicerade embryona visade bakgrundsfluorescens i hjärnkammaren. De anti-Dld-Atto-647N-injicerade zebrafiskembryona visade stora mängder internaliserade fluorescerande partiklar i de flesta celler i den utvecklande framhjärnan. Time lapse-avbildning visade rörelsen av intracellulära Anti-Dld-Atto-647N-endosomer under celldelning.De flesta mitotiska radiella gliaprogenitorer visade främre eller bakre asymmetrisk segregering av anti-Dld-Atto-647N-endosomer i två dotterceller. Asymmetrin stabiliserades mot slutet av anafasen, vilket resulterade i asymmetriskt arv av hacksignalendosomer av dottercellerna efteråt. Se till att nålen har satts in i den dolda märkesventrikeln på rätt ställe och kontrollera om det finns något läckage efter mikroinjektion.Förutom märkning av notch delta-signalering är protokollet tillämpligt för märkning av andra membranproteiner eller extracellulära proteiner med liknande strategier, om en bra antikropp mot den extracellulära domänen är tillgänglig.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex vivo Kultur av Pharyngeal Arches att studera hjärta och muskelstamfäder och deras nisch

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Spåra celler i GFP-transgen zebrafisk Använda Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Observation Mitotisk Division och dynamik i en Live Zebrafisk Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regisserad differentiering av primitiv och slutgiltig hematopoetiska progenitorceller från mänskliga pluripotenta stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo avbildning av Transgena genuttryck i Individuell Retinal stamceller i chimär Zebrafish embryon att studera Cell Nonautonomous Influenser

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Histologiska analyser av akut alkoholhaltig leverskada i sebrafisk

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levande cellen avbildning av kromosomsegregering under Mitos

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Beredning av Drosophila Larval och Pupal Testes för analys av celldelning i levande, intakt vävnad

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Definiera programmet för moderns mRNA-översättning under in vitro-mognad med hjälp av en enda Oocyte Reporter-analys

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

In situ Hybridisering hos zebrafisk larver och ungdomar under Mesonephros utveckling

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...