Name: adipocyte-specific atac-seq with adipose tissues using fluorescence-activated nucleus sorting
Uploaded: 2023-03-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting at JoVE.com

这项工作得到了IUSM Showalter研究信托基金（致H.C.R.），IUSM糖尿病和代谢疾病中心试点和可行性资助（致H.C.R.），国家糖尿病，消化和肾脏疾病研究所（R01DK129289至H.C.R.）和美国糖尿病协会初级教师奖（7-21-JDF-056至H.C.R.）的支持。

动物护理和实验是根据印第安纳大学医学院机构动物护理和使用委员会批准的程序进行的。
1. 实验开始前的准备工作
<ol><li>组织制备<ol><li>对于脂肪细胞核标记，将NuTRAP小鼠与脂肪细胞特异性脂联素-Cre系（Adipoq-Cre）杂交以产生Adipoq-NuTRAP小鼠，其对Adipoq-Cre和NuTRAP都是半合的。</li>
		<li>如前所述，从Adipoq-NuTRAP小鼠中解剖感兴趣的脂肪组织14。</li...

<ol>
	<li>Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+Adipocyte+biology.+Adipose+tissue+function+and+plasticity+orchestrate+nutritional+adaptation.">Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation.</a> Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).</li><li>Bielczyk-Maczynska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+adipocyte+plasticity+in+physiology+and+disease.">White adipocyte plasticity in physiology and disease.</a> Cells. 8 (12), 1507 (2019).</li><li>Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipogenic+transcriptome+profiling+using+high+throughput+technologies.">Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies.</a> Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).</li><li>Esteve Rafols, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+Cell+heterogeneity+and+functional+diversity.">Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity.</a> Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).</li><li>Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+white+adipose+tissue:+Molecular+basis+and+clinical+implications.">Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications.</a> Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo.">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocytes+fail+to+maintain+cellular+identity+during+obesity+due+to+reduced+PPAR&#947;+activity+and+elevated+TGF&#946;-SMAD+signaling.">Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPAR&#947; activity and elevated TGF&#946;-SMAD signaling.</a> Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Warming+induces+significant+reprogramming+of+beige,+but+not+brown,+adipocyte+cellular+identity.">Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity.</a> Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+analysis+in+human+early+development+reveals+epigenetic+transition+during+ZGA.">Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA.</a> Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).</li><li>Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+dissection+of+diverse+mouse+adipose+depots.">Identification and dissection of diverse mouse adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).</li><li>So, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cAMP+activation+induces+adipocyte+browning+through+discordant+biphasic+remodeling+of+transcriptome+and+chromatin+accessibility.">Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility.</a> Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).</li><li>Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+GFP-tagged+nuclei+from+frozen+livers+of+INTACT+mice+for+RNA-+and+ATAC-sequencing.">Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).</li><li>Heyward, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genomic+analysis+of+AgRP+neurons+reveals+that+IRF3+regulates+leptin's+hunger-suppressing+effects.">Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects.</a> bioRxiv. , (2022).</li></ol>

在本文中，我们提出了一种优化的ATAC-seq协议来评估 体内脂肪细胞特异性染色质的可及性。该ATAC-seq方案使用Adipoq-NuTRAP小鼠成功生成了脂肪细胞特异性染色质可及性图谱。成功和可重复的ATAC-seq实验的最关键因素是细胞核质量。至关重要的是立即将解剖的脂肪组织快速冷冻在液氮中，并将其安全地储存在-80°C下，而无需解冻直至使用。在细胞核分离和分选过程中防止脂肪细胞核损伤也很重?...

脂肪组织专门用于以脂质分子的形式储存多余的能量，是代谢调节的关键器官。严格控制脂肪细胞的形成和维持对脂肪组织功能和全身能量稳态至关重要1.许多转录调节因子在控制脂肪细胞分化、可塑性和功能方面起着关键作用;其中一些调节因子与人类代谢紊乱有关2，3。用于基因表达和表观基因组分析的高通量测序技术的最新进展进一步促进了脂肪细胞生物学分子调节因子的发现4。由于脂肪组织的异质性，使用脂肪组织的分子分析研究具有挑战性。脂肪组织主要由负责脂肪储存的脂肪细胞组成，但也包含各种其他细胞类型，如成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞5。此外，脂肪组织的细胞组成响应于病理生理变化（例如温度和营养状况）而发生显着改变6。为了克服这些问题，我们之前开发了一种转基因报告小鼠，名为核标记和翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP），它以Cre重组酶依赖的方式产生GFP标记的核糖体和mCherry标记的生物素化细胞核7。双标记系统使人能够对组织进行细胞类型特异性转录组学和表观基因组学分析。使用NuTRAP小鼠与脂肪细胞特异性脂联素-Cre系（Adipoq-NuTRAP）杂交，我们先前表征了体内纯脂肪细胞群的基因表达谱和染色质状态，并确定它们在肥胖期间如何改变7，8。以前，NuTRAP小鼠与棕色和米色脂肪细胞特异性Ucp1-Cre系（Ucp1-NuTRAP）杂交，使我们能够表征罕见的产热脂肪细胞群体米色脂肪细胞的表观基因组重塑，以响应温度变化9。
ATAC-seq是一种广泛使用的分析方法，用于评估全基因组染色质的可及性。ATAC-seq 中使用的超反应性 Tn5 转座酶允许通过在细胞核 10 的染色质可及区域中标记测序接头来鉴定开放的染色质区域。ATAC-seq是一种简单的方法，但它提供了可靠的结果，即使对于低输入样品也非常高效。因此，它已成为最流行的表观基因组分析方法之一，并有助于理解不同生物学背景下基因表达的调控机制。自创建原始ATAC-seq协议以来，已经进一步开发了各种ATAC-seq衍生技术，以修改和优化各种类型的样品的协议。例如，Fast-ATAC设计用于分析血细胞样本11，Omni-ATAC是冷冻组织样本12的优化方案，MiniATAC-seq对早期胚胎分析有效13。然而，将ATAC-seq方法应用于脂肪细胞，特别是来自组织样本的脂肪细胞，仍然具有挑战性。除了脂肪组织的异质性外，即使在细胞核分离后，其高脂质含量也可能干扰Tn5转座酶的有效重组反应。此外，脂肪细胞中的高线粒体含量，特别是在棕色和米色脂肪细胞中，导致线粒体DNA污染高和测序读数浪费。本文描述了使用Adipoq-NuTRAP小鼠的脂肪细胞特异性ATAC-seq方案（图1）。通过利用荧光标记的细胞核分选，该协议允许收集远离其他混杂细胞类型的纯脂肪细胞核群，并有效去除脂质、线粒体和组织碎片。因此，与标准方案相比，该协议可以生成特定于细胞类型的高质量数据，并最大限度地减少线粒体读取的浪费，同时使用更少的输入和试剂量。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adiponectin-Cre mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuTRAP mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>29899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA-LoBind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>86-923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x TD buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>15027866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR plate</td>
			<td>Applied biosystem</td>
			<td>4483285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP reagent (SPRI beads)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear adhesive film</td>
			<td>Applied biosystem</td>
			<td>4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-free distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 side skirted magnet</td>
			<td>Thermo Fishers</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>28719128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBH-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2134015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2 M)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>MT-252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips</td>
			<td>EpiCypher</td>
			<td>10-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>MT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>M0541S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Thermo Fishers</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR 8-tube strip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-4708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Fishers</td>
			<td>78439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green I (10,000x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDE I enzyme</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>15027865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSAria Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fishers</td>
			<td>QuantStudio&#8239;5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adipocyte-specific atac-seq with adipose tissues using fluorescence-activated nucleus sorting

转座酶可接近染色质的高通量测序 （ATAC-seq） 检测是一种强大的技术，可实现全基因组染色质可及性分析。该技术有助于理解一系列生物过程中基因表达的调控机制。尽管ATAC-seq已针对不同类型的样品进行了修改，但尚未对脂肪组织的ATAC-seq方法进行有效修改。脂肪组织面临的挑战包括复杂的细胞异质性、高脂质含量和高线粒体污染。为了克服这些问题，我们开发了一种协议，通过采用荧光激活的细胞核分选与来自转基因报告基因核标记和翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP）小鼠的脂肪组织，允许脂肪细胞特异性ATAC-seq。该协议以最少的测序读数浪费产生高质量的数据，同时减少了细胞核输入和试剂的数量。本文为ATAC-seq方法提供了详细的分步说明，该方法验证了使用从小鼠脂肪组织中分离的脂肪细胞核。该协议将有助于研究脂肪细胞在各种生物刺激下的染色质动力学，这将允许新的生物学见解。

为了使用这种ATAC-seq协议分析脂肪组织，我们生成了喂食食物饮食的Adipoq-NuTRAP小鼠;然后，我们使用流式细胞术从附睾白色脂肪组织（eWAT），腹股沟白色脂肪组织（iWAT）和棕色脂肪组织（BAT）中分离脂肪细胞核。如上所述，分离的细胞核用于标记，然后进行DNA纯化，PCR扩增，质量检查步骤，测序和数据分析。这个代表性实验的目的是分析从不同脂肪库分离的纯脂肪细胞群的染色质可及性。
<p cl...

Watch this Scientific Journal Video about Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting at JoVE.com

Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting

我们提出了一种用于转座酶可访问染色质的高通量测序（ATAC-seq）测定的方案，专门针对脂肪细胞，使用细胞核分选，从具有核荧光标记的转基因报告小鼠中分离的脂肪组织。

使用荧光激活细胞核分选的脂肪细胞特异性ATAC-Seq与脂肪组织

Assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a robust technique that enables genome-wide chromatin ...

ATAC-seq是了解基因表达调控机制的强大技术。然而，脂肪组织很难使用这种技术，因为它的脂质含量大，线粒体污染高，细胞异质性强。在该协议中，使用荧光激活的细胞核分选进行脂肪细胞特异性ATAC测序，该分选以最小的线粒体DNA污染生成高质量的数据。该方法也可用于其他组织，其中细胞类型特异性Cre小鼠系具有核标记转基因报告系。通过冷却玻璃 Dounce 均质器在冰上开始细胞核分离，每个样品使用一杯 Dounce。然后，向每杯 Dounce 中加入 7 毫升 NPB 混合物。然后，将 50 到 100 毫克的冷冻脂肪组织放入玻璃杯 Dounce 中，并用一把长剪刀将其切成几小块。用松散的杵对所有样品进行10次描边，然后用紧杵描10次。通过100微米过滤器将内容物过滤到新的50毫升管中，然后将过滤后的匀浆转移到15毫升管中进行离心。除去上清液后，通过轻柔但彻底的手指敲击将沉淀重悬于500微升PBS-N中。接下来，通过 40 微米过滤器将悬浮液过滤到 50 毫升管中，并用 250 微升 PBS-N 冲洗过滤器。使用微量移液器将过滤后的核悬浮液转移到荧光激活细胞分选或FACS管中。通过将 500 微升 PBS-N 添加到新的 1.5 毫升管中来准备收集管，并将其倒置几次以用缓冲液润湿所有内表面。短暂旋转试管以降低所有液体，然后将它们放在冰上直到分类。对于FACS，使用FSC-A/FSC-H门控清除单线，使用FSC-A/SSC-A清除小碎片或大碎片。门用于mCherry/GFP阳性脂肪细胞核群，并在先前准备的每个收集管中收集10， 000个细胞核。对于分选后细胞核制备，向每个收集管中加入 500 微升 PBS-N，并通过倒置管几次进行混合，然后在 200 G 下在 4 摄氏度下离心收集管 10 分钟。完全除去上清液。要制备 25 μL Tn5 主混合物，请混合 12.5 μL 2x 标记 DNA 缓冲液或 TD 缓冲液、1.25 μL Tn5 转座酶或 TDE I 酶和 11.25 μL 无核酸酶水。接下来，向每个细胞核沉淀中加入 25 微升 Tn5 主混合物，并通过轻柔移液将其重悬。使用热混合器在 600 rpm 下在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。将25微升无核酸酶的水加入25微升Tn5核重悬液的混合物中，使最终体积为50微升。然后，加入250微升缓冲液PB和5微升pH 5.2的3M乙酸钠。将混合物转移到参考试剂盒提供的色谱柱中后，在室温下以17， 900 G离心1分钟。丢弃流通后，将离心柱放回同一收集管中。向管中加入750微升含有无水乙醇的缓冲PE。离心柱，丢弃流出物，然后将离心柱放回同一收集管中。离心管，并丢弃带有流出物的收集管。为了扩增转置的DNA片段，在不添加独特的Ad2的情况下制备PCR主混合物。n 条形码入门。运行 PCR。运行定量 PCR 或 qPCR。检查扩增曲线，并通过估计达到最大值约35%的循环次数来确定所需的额外PCR循环次数。使用计算对剩余的 45 微升 PCR 反应运行 PCR。使用早期程序，用20微升缓冲液EB洗脱扩增的DNA片段。将洗脱的DNA转移到新的PCR管中，并通过加入80微升缓冲液EB将体积调节至100微升。接下来，加入 55 微升 SPRI 珠并通过移液混合。在室温下孵育5分钟后，将其在迷你磁性支架上分离5分钟。完成后，将150微升上清液转移到新的PCR管中，加入95微升SPRI珠，并通过移液混合。将反应孵育5分钟，然后在迷你磁性支架上分离珠子。小心丢弃上清液，并使用200微升70%乙醇洗涤珠子1分钟。再重复两次洗涤。最后一次洗涤后，将试管以1000 G离心1分钟。移出剩余的乙醇，并在打开盖子的PCR机上在37摄氏度下干燥沉淀2分钟。干燥后，通过移液将沉淀重悬于20微升缓冲液EB中，并在室温下孵育管5分钟。在迷你磁性支架上分离珠子5分钟，然后将含有最终文库的18微升上清液转移到新的1.5毫升管中。mCherry标记和GFP标记的脂肪细胞核可与从Adipoq-NuTRAP小鼠的脂肪组织中分离的其他细胞类型细胞核区分开来。根据脂肪库的类型，在脂肪细胞组分中观察到eWAT的差异约为50%，iWAT的差异约为30%，BAT的差异约为65%。需要超过15个PCR循环的样品表明样品质量低下。ATAC-seq文库的大小分布分析显示，多个峰对应于无核小体区（NFR），以及单核、二核和多核小体，平均大小约为500至800个碱基对。质量差的样品通常主要显示NFR，没有或很少有核小体峰。qRT-PCR分析的质量检查测试显示，脂肪细胞标记基因（如Adipoq，Fabp4，Plin1和Pnpla2）附近的阳性基因组元素富集了10至20倍，而阴性对照组未显示富集。产热基因Ucp1的富集在BAT中特异性地观察到。线粒体读数小于2%，峰下分数约为18%至44%在所有脂肪库的脂肪细胞标记基因（如Adipoq，Fabp4和Plin1）附近发现了多个具有高信噪比的强峰。在BAT样品中的棕色脂肪细胞标记Ucp1位点观察到强烈的ATAC-seq峰。该协议的最关键因素是细胞核质量。重要的是使用高质量的组织样品并在整个实验过程中轻柔地处理细胞核，尤其是在离心和分选后的重悬期间。重要的是要记住，该协议依赖于具有核标记的转基因报告小鼠。这里使用了NuTRAP小鼠，但可以使用任何类似的系统。利用我们的FACS数据，人们可以进行计算多重分析，以找到在生物学环境中调节基因表达的关键转录组因子。

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

为患者组织甲基结合DNA序列捕获

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

科研

遗传学

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

经典霍奇金淋巴瘤的芦苇细胞的流分选和外显子测序

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

单细胞基因表达谱使用流式细胞仪和qPCR内部标准

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

高分辨率荧光原位杂交在果蝇胚胎和组织中使用 Tyramide 信号放大

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

ATAC 基因组在原发性人类 T 淋巴细胞中的染色体全易接近染色质

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

无基因克隆的基因破坏的变形链球菌菌株的生成

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

用 BIBAC 二元矢量生成单拷贝插入的转基因植物

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

小鼠棕色脂肪组织的染色质免疫沉淀

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

基于荧光的感染组织细菌基因调控方法

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...