Name: adipocyte-specific atac-seq with adipose tissues using fluorescence-activated nucleus sorting
Uploaded: 2023-03-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af IUSM Showalter Research Trust Fund (til HCR), et IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (til HCR), National Institute of Diabetes og fordøjelses- og nyresygdomme (R01DK129289 til HCR) og American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 til HCR).

Dyrepleje og eksperimenter blev udført i henhold til procedurer godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Indiana University School of Medicine.
1. Forberedelser inden forsøget påbegyndes
<ol><li>Vævsforberedelse<ol><li>Til mærkning af adipocytkerner krydses NuTRAP-mus med adipocytspecifikke adiponectin-Cre-linjer (Adipoq-Cre) for at generere Adipoq-NuTRAP-mus, som er hemizygote for både Adipoq-Cre og NuTRAP.</li>
		<li>Dissekere fedtvæv af interesse ...

<ol>
	<li>Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+Adipocyte+biology.+Adipose+tissue+function+and+plasticity+orchestrate+nutritional+adaptation.">Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation.</a> Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).</li><li>Bielczyk-Maczynska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+adipocyte+plasticity+in+physiology+and+disease.">White adipocyte plasticity in physiology and disease.</a> Cells. 8 (12), 1507 (2019).</li><li>Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipogenic+transcriptome+profiling+using+high+throughput+technologies.">Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies.</a> Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).</li><li>Esteve Rafols, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+Cell+heterogeneity+and+functional+diversity.">Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity.</a> Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).</li><li>Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+white+adipose+tissue:+Molecular+basis+and+clinical+implications.">Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications.</a> Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo.">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocytes+fail+to+maintain+cellular+identity+during+obesity+due+to+reduced+PPAR&#947;+activity+and+elevated+TGF&#946;-SMAD+signaling.">Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPAR&#947; activity and elevated TGF&#946;-SMAD signaling.</a> Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Warming+induces+significant+reprogramming+of+beige,+but+not+brown,+adipocyte+cellular+identity.">Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity.</a> Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+analysis+in+human+early+development+reveals+epigenetic+transition+during+ZGA.">Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA.</a> Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).</li><li>Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+dissection+of+diverse+mouse+adipose+depots.">Identification and dissection of diverse mouse adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).</li><li>So, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cAMP+activation+induces+adipocyte+browning+through+discordant+biphasic+remodeling+of+transcriptome+and+chromatin+accessibility.">Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility.</a> Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).</li><li>Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+GFP-tagged+nuclei+from+frozen+livers+of+INTACT+mice+for+RNA-+and+ATAC-sequencing.">Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).</li><li>Heyward, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genomic+analysis+of+AgRP+neurons+reveals+that+IRF3+regulates+leptin's+hunger-suppressing+effects.">Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects.</a> bioRxiv. , (2022).</li></ol>

I dette papir har vi præsenteret en optimeret ATAC-seq-protokol til vurdering af adipocytspecifik kromatintilgængelighed in vivo. Denne ATAC-seq-protokol, der bruger Adipoq-NuTRAP-musen, genererede med succes adipocytspecifikke kromatintilgængelighedsprofiler. Den mest kritiske faktor for vellykkede og reproducerbare ATAC-seq-eksperimenter er kernekvaliteten. Det er vigtigt straks at snapfryse det dissekerede fedtvæv i flydende nitrogen og opbevare dem sikkert ved -80 °C uden optøning indtil brug. Det er o...

Fedtvæv, der er specialiseret til opbevaring af overskydende energi i form af lipidmolekyler, er et nøgleorgan til metabolisk regulering. Den strenge kontrol af adipocytdannelse og vedligeholdelse er afgørende for fedtvævsfunktion og helkropsenergihomeostase1. Mange transkriptionelle regulatorer spiller en kritisk rolle i kontrollen af adipocytdifferentiering, plasticitet og funktion; Nogle af disse regulatorer er impliceret i metaboliske lidelser hos mennesker 2,3. Nylige fremskridt inden for high-throughput sekventeringsteknikker til genekspression og epigenomisk analyse har yderligere lettet opdagelsen af de molekylære regulatorer af adipocytbiologi4. Molekylære profileringsundersøgelser ved hjælp af fedtvæv er udfordrende at gennemføre på grund af heterogeniteten af disse væv. Fedtvæv består primært af adipocytter, som er ansvarlige for fedtopbevaring, men indeholder også forskellige andre celletyper, såsom fibroblaster, endotelceller og immunceller5. Derudover ændres fedtvævets cellulære sammensætning dramatisk som reaktion på patofysiologiske ændringer såsom temperatur og ernæringsstatus6. For at overvinde disse problemer har vi tidligere udviklet en transgen reportermus, kaldet Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), som producerer GFP-mærkede ribosomer og mCherry-mærkede biotinylerede kerner på en Cre-rekombinaseafhængig måde7. Dobbeltmærkningssystemet gør det muligt at udføre celletypespecifik transkriptomisk og epigenomisk analyse med væv. Ved hjælp af NuTRAP-mus krydset med adipocytspecifikke adiponectin-Cre-linjer (Adipoq-NuTRAP) har vi tidligere karakteriseret genekspressionsprofiler og kromatintilstande fra rene adipocytpopulationer in vivo og bestemt, hvordan de ændres under fedme 7,8. Tidligere tillod NuTRAP-mus krydset med brune og beige adipocytspecifikke Ucp1-Cre-linjer (Ucp1-NuTRAP) os at karakterisere den epigenomiske ombygning af den sjældne termogene adipocytpopulation, beige adipocytter, som reaktion på temperaturændringer9.
ATAC-seq er en meget anvendt analysemetode til vurdering af genom-dækkende kromatintilgængelighed. Den hyperreaktive Tn5-transposase, der anvendes i ATAC-seq, muliggør identifikation af åbne kromatinregioner ved at mærke sekventeringsadaptere i det kromatintilgængelige område af kerner10. ATAC-seq er en simpel metode, men den giver robuste resultater og er yderst effektiv selv med prøver med lavt input. Det er således blevet en af de mest populære epigenomiske profileringsmetoder og har bidraget til forståelsen af de regulerende mekanismer for genekspression inden for forskellige biologiske sammenhænge. Siden den oprindelige ATAC-seq-protokol blev oprettet, er forskellige ATAC-seq-afledte teknikker blevet videreudviklet til at ændre og optimere protokollen til forskellige typer prøver. For eksempel er Fast-ATAC designet til analyse af blodcelleprøver11, Omni-ATAC er en optimeret protokol til frosne vævsprøver12, og MiniATAC-seq er effektiv til embryoanalyse i tidlig fase13. Anvendelse af ATAC-seq-metoden på adipocytter, især fra vævsprøver, er dog stadig udfordrende. Ud over heterogeniteten af fedtvæv kan dets høje lipidindhold interferere med effektive rekombinationsreaktioner ved Tn5-transposase, selv efter kerneisolering. Desuden forårsager det høje mitokondrieindhold i adipocytter, især i brune og beige adipocytter, høj mitokondriel DNA-forurening og spildte sekventeringslæsninger. Dette papir beskriver en protokol for adipocytspecifik ATAC-seq ved hjælp af Adipoq-NuTRAP-mus (figur 1). Ved at drage fordel af fluorescensmærket kernesortering tillader denne protokol indsamling af rene populationer af adipocytkerner væk fra andre forvirrende celletyper og effektiv fjernelse af lipider, mitokondrier og vævsaffald. Derfor kan denne protokol generere celletypespecifikke data af høj kvalitet og minimere spild fra mitokondrielæsninger, mens der bruges en reduceret mængde input og reagenser sammenlignet med standardprotokollen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adiponectin-Cre mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuTRAP mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>29899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA-LoBind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>86-923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x TD buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>15027866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR plate</td>
			<td>Applied biosystem</td>
			<td>4483285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP reagent (SPRI beads)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear adhesive film</td>
			<td>Applied biosystem</td>
			<td>4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-free distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 side skirted magnet</td>
			<td>Thermo Fishers</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>28719128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBH-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2134015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2 M)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>MT-252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips</td>
			<td>EpiCypher</td>
			<td>10-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>MT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>M0541S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Thermo Fishers</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR 8-tube strip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-4708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Fishers</td>
			<td>78439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green I (10,000x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDE I enzyme</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>15027865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSAria Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fishers</td>
			<td>QuantStudio&#8239;5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adipocyte-specific atac-seq with adipose tissues using fluorescence-activated nucleus sorting

Assay for transposase-tilgængeligt kromatin med high-throughput sekventering (ATAC-seq) er en robust teknik, der muliggør genom-dækkende kromatintilgængelighedsprofilering. Denne teknik har været nyttig til at forstå reguleringsmekanismerne for genekspression i en række biologiske processer. Selvom ATAC-seq er blevet modificeret til forskellige typer prøver, har der ikke været effektive ændringer af ATAC-seq-metoder til fedtvæv. Udfordringer med fedtvæv omfatter den komplekse cellulære heterogenitet, stort lipidindhold og høj mitokondriel forurening. For at overvinde disse problemer har vi udviklet en protokol, der tillader adipocytspecifik ATAC-seq ved at anvende fluorescensaktiveret kernesortering med fedtvæv fra den transgene reporter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus. Denne protokol producerer data af høj kvalitet med minimal spildt sekventeringslæsning, samtidig med at mængden af kerneinput og reagenser reduceres. Dette papir indeholder detaljerede trinvise instruktioner til ATAC-seq-metoden, der er valideret til brug af adipocytkerner isoleret fra musefedtvæv. Denne protokol vil hjælpe med undersøgelsen af kromatindynamik i adipocytter ved forskellige biologiske stimuleringer, hvilket vil give mulighed for ny biologisk indsigt.

For at analysere fedtvæv ved hjælp af denne ATAC-seq-protokol genererede vi Adipoq-NuTRAP-mus, der blev fodret med chow-diæter; vi isolerede derefter adipocytkerner fra epididymalt hvidt fedtvæv (eWAT), inguinalt hvidt fedtvæv (iWAT) og brunt fedtvæv (BAT) ved hjælp af flowcytometri. De isolerede kerner blev brugt til mærkning efterfulgt af DNA-oprensning, PCR-amplifikation, kvalitetskontroltrin, sekventering og dataanalyse som beskrevet ovenfor. Formålet med dette repræsentative eksperiment var at profilere kr...

Watch this Scientific Journal Video about Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting at JoVE.com

Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting

Vi præsenterer en protokol til assay for transposase-tilgængeligt kromatin med high-throughput sekventering (ATAC-seq) specifikt på adipocytter ved hjælp af kernesortering med fedtvæv isoleret fra transgene reportermus med nuklear fluorescensmærkning.

Adipocytspecifik ATAC-Seq med fedtvæv ved hjælp af fluorescensaktiveret kernesortering

Assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a robust technique that enables genome-wide chromatin ...

ATAC-seq er en kraftfuld teknik til at forstå genekspressionsregulerende mekanismer. Imidlertid er fedtvæv vanskeligt ved hjælp af denne teknik på grund af dets store lipidindhold, høj mitokondrieforurening og cellulær heterogenitet. I denne protokol blev adipocytspecifik ATAC-sekventering udført under anvendelse af fluorescensaktiveret kernesortering, som genererer data af høj kvalitet med minimal mitokondriel DNA-forurening.Denne metode kan også anvendes i andre væv, hvor celletypespecifikke Cre-muselinjer er tilgængelige med nukleare mærkningstransgene reporterlinjer. Begynd kerneisoleringen ved at afkøle glasset Dounce homogenisatorer på is med et glas Dounce pr. Prøve. Derefter tilsættes 7 ml NPB-blandingen til hvert glas Dounce.Placer derefter 50 til 100 milligram frosset fedtvæv i glasset Dounce, og skær det i et par mindre stykker ved hjælp af en lang saks. Slag 10 gange med en løs stød for alle prøverne, og derefter 10 gange med en stram støder. Indholdet filtreres gennem en 100 mikrometer sil over i et nyt 50 ml rør, inden de filtrerede homogenater overføres til et 15 ml rør til centrifugering.Efter fjernelse af supernatanten resuspenderes pellet i 500 mikroliter PBS-N ved forsigtig, men grundig fingerbankning. Derefter filtreres suspensionen gennem en 40 mikrometer sil i et 50 ml rør og skylles silen med 250 mikroliter PBS-N. Den filtrerede nukleare suspension overføres til en fluorescensaktiveret cellesortering eller FACS-tube ved hjælp af en mikropipette.Forbered opsamlingsrøret ved at tilføje 500 mikroliter PBS-N til det nye 1,5 milliliter rør, og vend det et par gange for at våde alle indre overflader med bufferen. Drej kortvarigt rørene for at bringe al væsken ned, før du lægger dem på is indtil sortering. Til FACS skal du bruge FSC-A/FSC-H-gatingen til singlets og FSC-A/SSC-A til fjernelse af små eller store snavs.Gate for den mCherry / GFP-positive adipocytkernepopulation, og saml 10.000 kerner i hvert opsamlingsrør, der er forberedt tidligere. Til eftersortering af kerneforberedelse tilsættes 500 mikroliter PBS-N til hvert opsamlingsrør og blandes ved at vende røret et par gange, før opsamlingsrørene centrifugeres ved 200 G i 10 minutter ved 4 grader Celsius. Supernatanten fjernes helt.For at forberede 25 mikroliter Tn5-masterblanding blandes 12,5 mikroliter 2x tagmentations-DNA-buffer eller TD-buffer, 1,25 mikroliter Tn5-transposase eller TDE I-enzym og 11,25 mikroliter nukleasefrit vand. Derefter tilsættes 25 mikroliter Tn5-masterblanding til hver kernepille og resuspenderes ved forsigtig pipettering. Inkuber ved 600 RPM i 30 minutter ved 37 grader Celsius ved hjælp af en termisk mixer.Tilsæt 25 mikroliter nukleasefrit vand til de 25 mikroliter af blandingen af Tn5-kerneresuspension, hvilket gør det endelige volumen på 50 mikroliter. Derefter tilsættes 250 mikroliter buffer PB og 5 mikroliter 3 M natriumacetat med pH 5,2. Efter overførsel af blandingen til en kolonne, der leveres med referencesættet, centrifugeres den ved 17.900 G i 1 minut ved stuetemperatur.Når gennemstrømningen er kasseret, skal du placere en centrifugeringssøjle tilbage i det samme opsamlingsrør. Tilsæt 750 mikroliter buffer PE indeholdende absolut ethanol til røret. Centrifuger søjlen, kassér gennemstrømningen, og placer centrifugeringssøjlen tilbage i det samme opsamlingsrør.Centrifuger røret, og kassér opsamlingsrøret med gennemstrømningen. For at forstærke de transponerede DNA-fragmenter skal du forberede PCR-masterblandingen uden at tilføje en unik Ad2. n stregkode primer.Kør PCR. Kør den kvantitative PCR eller qPCR. Kontroller forstærkningskurverne, og identificer antallet af yderligere PCR-cyklusser, der er nødvendige, ved at estimere antallet af cyklusser, der nåede ca. 35% af maksimumet.Brug beregningerne til at køre PCR for de resterende 45 mikroliter PCR-reaktion. Ved hjælp af de tidligere procedurer elueres de amplificerede DNA-fragmenter med 20 mikroliter buffer EB. Overfør det eluerede DNA til et nyt PCR-rør og juster lydstyrken til 100 mikroliter ved at tilsætte 80 mikroliter buffer EB. Derefter tilsættes 55 mikroliter SPRI-perler og blandes ved pipettering. Efter 5 minutters inkubation ved stuetemperatur adskilles den på et mini magnetisk stativ i 5 minutter.Når det er gjort, overføres 150 mikroliter supernatant til et nyt PCR-rør, der tilsættes 95 mikroliter SPRI-perler, og blandes ved pipettering. Inkuber reaktionen i 5 minutter, før perlerne adskilles på det magnetiske stativ. Supernatanten kasseres omhyggeligt og perlerne vaskes i 1 minut med 200 mikroliter 70 % ethanol.Gentag yderligere to vaske. Efter den sidste vask centrifugeres glassene ved 1000 G i 1 minut. Pipette den resterende ethanol ud og tør pelleten ved 37 grader Celsius i 2 minutter på en PCR-maskine med låget åbent.Når pelleten er tørret, resuspenderes den i 20 mikroliter buffer EB ved pipettering og inkuberes røret i 5 minutter ved stuetemperatur. Perlerne adskilles i 5 minutter på det magnetiske ministativ, før 18 mikroliter supernatanten indeholdende det endelige bibliotek overføres til et nyt 1,5 ml-glas. mCherry-mærkede og GFP-mærkede adipocytkerner kunne skelnes fra de andre celletyper kerner isoleret fra fedtvævet i en Adipoq-NuTRAP-mus.Afhængigt af typen af fedtdepot er forskellen på ca. 50% i eWAT, 30% i iWAT og 65% i BAT blev observeret i adipocytfraktionerne. De prøver, der krævede mere end 15 PCR-cyklusser, indikerede prøver af lav kvalitet. Størrelsesfordelingsanalysen af ATAC-seq-bibliotekerne viste flere toppe svarende til den nukleosomfrie region eller NFR og mono-, di- og multinukleosomer med gennemsnitlige størrelser på ca. 500 til 800 basepar.Prøver af dårlig kvalitet viste typisk for det meste NFR med ingen eller få nukleosomale toppe. Kvalitetskontroltestene ved qRT-PCR-analysen viste 10 til 20 gange berigelser med de positive genomiske elementer nær adipocytmarkørgener såsom Adipoq, Fabp4, Plin1 og Pnpla2, mens der ikke blev vist nogen berigelse med den negative kontrol. Berigelsen med det termogene gen Ucp1 blev observeret specifikt i BAT.Mitokondrieaflæsningerne var mindre end 2%, og fraktionen under toppene var ca. 18% til 44%Flere stærke toppe med høje signal-støj-forhold blev afsløret nær adipocytmarkørgener såsom Adipoq, Fabp4 og Plin1 fra alle fedtdepoterne. Der blev observeret stærke ATAC-seq-toppe ved den brune adipocytmarkør Ucp1 locus i BAT-prøven. Den mest kritiske faktor for denne protokol er kernekvalitet.Det er vigtigt at bruge vævsprøver af høj kvalitet og at håndtere kernerne forsigtigt under hele eksperimentet, især under resuspension efter centrifugering og sortering. Det er vigtigt at huske, at denne protokol er afhængig af transgene reportermus med nuklear mærkning. NuTRAP-mus blev brugt her, men ethvert lignende system kan bruges.Med vores FACS-data kan man udføre beregningsmultipel analyse for at finde nøgletranskriptomiske faktorer, der regulerer genekspression i biologiske omgivelser.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methyl-bindende DNA capture sekventering for Patient Væv

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Flowsortering og Exome-sekventering af Reed-Sternberg-cellerne af klassisk Hodgkin-lymfom

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Single-celle Gene Expression Profiling Brug FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høj opløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila fostre og væv ved hjælp af Tyramide Signal forstærkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Kortlægning Genome-wide tilgængelige kromatin i primære humane T lymfocytter af ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation af en gen-forstyrret Streptococcus mutans stamme uden Gene kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

Generering af transgene planter med enkelt-kopi indrykninger ved hjælp af BIBAC-GW binære vektor

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Kromatin Immunoprecipitation af Murine brunt fedtvæv

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Et fluorescens-baseret metode til at studere bakteriel RIBOREGULATION i smittet væv

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...