Name: adipocyte-specific atac-seq with adipose tissues using fluorescence-activated nucleus sorting
Uploaded: 2023-03-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av IUSM Showalter Research Trust Fund (til HCR), et IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (til HCR), National Institute of Diabetes og fordøyelses- og nyresykdommer (R01DK129289 til HCR), og American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 til HCR).

Dyrepleie og eksperimentering ble utført i henhold til prosedyrer godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Indiana University School of Medicine.
1. Forberedelser før forsøket begynner
<ol><li>Vev forberedelse<ol><li>For merking av adipocyttkjerner, kryss NuTRAP-mus med adipocyttspesifikke adiponektin-Cre-linjer (Adipoq-Cre) for å generere Adipoq-NuTRAP-mus, som er hemizygote for både Adipoq-Cre og NuTRAP.</li>
		<li>Dissekere fettvevene av interesse ...

<ol>
	<li>Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+Adipocyte+biology.+Adipose+tissue+function+and+plasticity+orchestrate+nutritional+adaptation.">Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation.</a> Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).</li><li>Bielczyk-Maczynska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+adipocyte+plasticity+in+physiology+and+disease.">White adipocyte plasticity in physiology and disease.</a> Cells. 8 (12), 1507 (2019).</li><li>Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipogenic+transcriptome+profiling+using+high+throughput+technologies.">Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies.</a> Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).</li><li>Esteve Rafols, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+Cell+heterogeneity+and+functional+diversity.">Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity.</a> Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).</li><li>Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+white+adipose+tissue:+Molecular+basis+and+clinical+implications.">Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications.</a> Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo.">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocytes+fail+to+maintain+cellular+identity+during+obesity+due+to+reduced+PPAR&#947;+activity+and+elevated+TGF&#946;-SMAD+signaling.">Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPAR&#947; activity and elevated TGF&#946;-SMAD signaling.</a> Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Warming+induces+significant+reprogramming+of+beige,+but+not+brown,+adipocyte+cellular+identity.">Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity.</a> Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+analysis+in+human+early+development+reveals+epigenetic+transition+during+ZGA.">Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA.</a> Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).</li><li>Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+dissection+of+diverse+mouse+adipose+depots.">Identification and dissection of diverse mouse adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).</li><li>So, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cAMP+activation+induces+adipocyte+browning+through+discordant+biphasic+remodeling+of+transcriptome+and+chromatin+accessibility.">Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility.</a> Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).</li><li>Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+GFP-tagged+nuclei+from+frozen+livers+of+INTACT+mice+for+RNA-+and+ATAC-sequencing.">Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).</li><li>Heyward, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genomic+analysis+of+AgRP+neurons+reveals+that+IRF3+regulates+leptin's+hunger-suppressing+effects.">Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects.</a> bioRxiv. , (2022).</li></ol>

I denne artikkelen har vi presentert en optimalisert ATAC-seq-protokoll for å vurdere adipocyttspesifikk kromatintilgjengelighet in vivo. Denne ATAC-seq-protokollen ved hjelp av Adipoq-NuTRAP-musen genererte vellykket adipocyttspesifikke kromatintilgjengelighetsprofiler. Den mest kritiske faktoren for vellykkede og reproduserbare ATAC-seq-eksperimenter er kjernekvalitet. Det er viktig å knipsefryse de dissekerte fettvevene umiddelbart i flytende nitrogen og oppbevare dem trygt ved -80 °C uten å tine før bru...

Fettvev, som er spesialisert for lagring av overflødig energi i form av lipidmolekyler, er et nøkkelorgan for metabolsk regulering. Den strenge kontrollen av adipocytdannelse og vedlikehold er avgjørende for fettvevsfunksjon og helkroppsenergihomeostase1. Mange transkripsjonsregulatorer spiller en kritisk rolle i kontrollen av adipocytdifferensiering, plastisitet og funksjon; Noen av disse regulatorene er involvert i metabolske forstyrrelser hos mennesker 2,3. Nylige fremskritt innen sekvenseringsteknikker med høy gjennomstrømning for genuttrykk og epigenomisk analyse har ytterligere lettet oppdagelsen av molekylære regulatorer av adipocytbiologi4. Molekylære profileringsstudier ved bruk av fettvev er utfordrende å gjennomføre på grunn av heterogeniteten til disse vevene. Fettvev består hovedsakelig av adipocytter, som er ansvarlige for fettlagring, men inneholder også forskjellige andre celletyper, som fibroblaster, endotelceller og immunceller5. I tillegg endres den cellulære sammensetningen av fettvev dramatisk som respons på patofysiologiske endringer som temperatur og ernæringsstatus6. For å overvinne disse problemene utviklet vi tidligere en transgen reportermus, kalt Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), som produserer GFP-merkede ribosomer og mCherry-merkede biotinylerte kjerner på en Cre rekombinase-avhengig måte7. Det doble merkingssystemet gjør det mulig å utføre celletypespesifikk transkriptomisk og epigenomisk analyse med vev. Ved hjelp av NuTRAP-mus krysset med adipocyttspesifikke adiponektin-Cre-linjer (Adipoq-NuTRAP), karakteriserte vi tidligere genuttrykksprofiler og kromatintilstander fra rene adipocyttpopulasjoner in vivo og bestemte hvordan de endres under fedme 7,8. Tidligere krysset NuTRAP-mus med brune og beige adipocyttspesifikke Ucp1-Cre-linjer (Ucp1-NuTRAP) oss å karakterisere den epigenomiske remodelleringen av den sjeldne termogene adipocytpopulasjonen, beige adipocytter, som respons på temperaturendringer9.
ATAC-seq er en mye brukt analytisk metode for å vurdere tilgjengeligheten av kromatin i hele genomet. Den hyperreaktive Tn5-transposasen som brukes i ATAC-seq, gjør det mulig å identifisere åpne kromatinregioner ved å merke sekvenseringsadaptere i det kromatintilgjengelige området av kjerner10. ATAC-seq er en enkel metode, men den gir robuste resultater og er svært effektiv selv med prøver med lav inngang. Det har dermed blitt en av de mest populære epigenomiske profileringsmetodene og har bidratt til forståelsen av reguleringsmekanismene for genuttrykk innenfor ulike biologiske sammenhenger. Siden den opprinnelige ATAC-seq-protokollen ble opprettet, har ulike ATAC-seq-avledede teknikker blitt videreutviklet for å modifisere og optimalisere protokollen for ulike typer prøver. For eksempel er Fast-ATAC designet for å analysere blodcelleprøver11, Omni-ATAC er en optimalisert protokoll for frosne vevsprøver 12, og MiniATAC-seq er effektiv for embryoanalyse på tidlig stadium13. Imidlertid er det fortsatt utfordrende å bruke ATAC-seq-metoden på adipocytter, spesielt fra vevsprøver. I tillegg til heterogeniteten i fettvev, kan dets høye lipidinnhold forstyrre effektive rekombinasjonsreaksjoner ved Tn5-transposase selv etter kjerneisolering. Videre forårsaker det høye mitokondrieinnholdet i adipocytter, spesielt i brune og beige adipocytter, høy mitokondriell DNA-forurensning og bortkastet sekvensering. Denne artikkelen beskriver en protokoll for adipocyttspesifikk ATAC-seq ved bruk av Adipoq-NuTRAP-mus (figur 1). Ved å dra nytte av fluorescensmerket kjernesortering, tillater denne protokollen innsamling av rene populasjoner av adipocytkjerner vekk fra andre forvirrende celletyper og effektiv fjerning av lipider, mitokondrier og vevsrester. Derfor kan denne protokollen generere celletypespesifikke data av høy kvalitet og minimere avfall fra mitokondrielle avlesninger mens du bruker redusert mengde inngang og reagenser sammenlignet med standardprotokollen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adiponectin-Cre mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuTRAP mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>29899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA-LoBind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>86-923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x TD buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>15027866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR plate</td>
			<td>Applied biosystem</td>
			<td>4483285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP reagent (SPRI beads)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear adhesive film</td>
			<td>Applied biosystem</td>
			<td>4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-free distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 side skirted magnet</td>
			<td>Thermo Fishers</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>28719128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBH-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2134015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2 M)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>MT-252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips</td>
			<td>EpiCypher</td>
			<td>10-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>MT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>M0541S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Thermo Fishers</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR 8-tube strip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-4708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Fishers</td>
			<td>78439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green I (10,000x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDE I enzyme</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>15027865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSAria Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fishers</td>
			<td>QuantStudio&#8239;5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adipocyte-specific atac-seq with adipose tissues using fluorescence-activated nucleus sorting

Analyse for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering (ATAC-seq) er en robust teknikk som muliggjør profilering av kromatintilgjengelighet i hele genomet. Denne teknikken har vært nyttig for å forstå reguleringsmekanismene for genuttrykk i en rekke biologiske prosesser. Selv om ATAC-seq har blitt modifisert for forskjellige typer prøver, har det ikke vært effektive modifikasjoner av ATAC-seq-metoder for fettvev. Utfordringer med fettvev inkluderer kompleks cellulær heterogenitet, stort lipidinnhold og høy mitokondriell forurensning. For å overvinne disse problemene har vi utviklet en protokoll som tillater adipocytt-spesifikk ATAC-seq ved å bruke fluorescensaktivert kjernesortering med fettvev fra den transgene reporteren Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus. Denne protokollen produserer data av høy kvalitet med minimal bortkastet sekvensering av avlesninger samtidig som mengden kjerneinngang og reagenser reduseres. Dette papiret gir detaljerte trinnvise instruksjoner for ATAC-seq-metoden validert for bruk av adipocyttkjerner isolert fra fettvev fra mus. Denne protokollen vil hjelpe til med undersøkelsen av kromatindynamikk i adipocytter ved ulike biologiske stimuleringer, noe som vil muliggjøre ny biologisk innsikt.

For å analysere fettvev ved hjelp av denne ATAC-seq-protokollen, genererte vi Adipoq-NuTRAP-mus som ble matet chow-dietter; Deretter isolerte vi adipocyttkjerner fra epididymalt hvitt fettvev (eWAT), inguinalt hvitt fettvev (iWAT) og brunt fettvev (BAT) ved hjelp av flowcytometri. De isolerte kjernene ble brukt til tagning, etterfulgt av DNA-rensing, PCR-amplifikasjon, kvalitetskontrolltrinn, sekvensering og dataanalyse, som beskrevet ovenfor. Formålet med dette representative eksperimentet var å profilere kromatintil...

Watch this Scientific Journal Video about Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting at JoVE.com

Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting

Vi presenterer en protokoll for analyse for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering (ATAC-seq) spesifikt på adipocytter ved bruk av kjernesortering med fettvev isolert fra transgene reportermus med kjernefysisk fluorescensmerking.

Adipocytt-spesifikk ATAC-Seq med fettvev ved bruk av fluorescensaktivert kjernesortering

Assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a robust technique that enables genome-wide chromatin ...

ATAC-seq er en kraftig teknikk for å forstå regulatoriske mekanismer for genuttrykk. Imidlertid er fettvev vanskelig å bruke denne teknikken på grunn av dets store lipidinnhold, høy mitokondriell forurensning og cellulær heterogenitet. I denne protokollen ble adipocyttspesifikk ATAC-sekvensering utført ved bruk av fluorescensaktivert kjernesortering, som genererer data av høy kvalitet med minimal mitokondriell DNA-forurensning.Denne metoden kan også brukes i andre vev der celletypespesifikke Cre-muselinjer er tilgjengelige med kjernefysisk merking transgene reporterlinjer. Begynn kjerneisolasjonen ved å kjøle ned glasset Dounce homogenisatorer på is med ett glass Dounce per prøve. Deretter tilsettes 7 ml av NPB-blandingen til hvert glass Dounce.Legg deretter 50 til 100 milligram frosset fettvev i glasset Dounce, og kutt det i noen mindre biter ved hjelp av en lang saks. Stroke 10 ganger med en løs pestle for alle prøvene, og deretter 10 ganger med en tett pestle. Filtrer innholdet gjennom en 100 mikrometer sil inn i et nytt 50 milliliters rør før du overfører de filtrerte homogenatene til et 15 milliliters rør for sentrifugering.Etter å ha fjernet supernatanten, resuspender pelleten i 500 mikroliter PBS-N ved forsiktig, men grundig fingertapping. Deretter filtrerer du suspensjonen gjennom en 40 mikrometer sil i et 50 milliliter rør og skyll silen med 250 mikroliter PBS-N. Overfør den filtrerte kjernefysiske suspensjonen til en fluorescensaktivert cellesortering eller FACS-rør ved hjelp av en mikropipette.Forbered oppsamlingsrøret ved å tilsette 500 mikroliter PBS-N til det nye 1,5 milliliters røret, og inverter det noen ganger for å fukte alle indre overflater med bufferen. Spinn rørene kort for å få ned all væsken før du legger dem på is til sortering. For FACS, bruk FSC-A / FSC-H gating for singlets og FSC-A / SSC-A for små eller store rusk fjerning.Gate for mCherry / GFP-positive adipocyttkjernepopulasjonen, og samle 10.000 kjerner i hvert samlingsrør utarbeidet tidligere. For ettersortering av kjernepreparasjon, tilsett 500 mikroliter PBS-N til hvert oppsamlingsrør og bland det ved å invertere røret noen ganger før du sentrifugerer oppsamlingsrørene ved 200 G i 10 minutter ved 4 grader Celsius. Fjern supernatanten helt.For å forberede 25 mikroliter Tn5-masterblanding, bland 12,5 mikroliter 2x tagmentasjons-DNA-buffer eller TD-buffer, 1,25 mikroliter Tn5-transposase eller TDE I-enzym og 11,25 mikroliter nukleasefritt vann. Deretter tilsettes 25 mikroliter Tn5-hovedblanding til hver kjernepellet og resuspenderes den ved forsiktig pipettering. Inkuber ved 600 o / min i 30 minutter ved 37 grader Celsius ved hjelp av en termisk mikser.Tilsett 25 mikroliter nukleasefritt vann til 25 mikroliter av blandingen av Tn5-kjerneresuspensjon, noe som gjør det endelige volumet på 50 mikroliter. Deretter tilsettes 250 mikroliter buffer PB og 5 mikroliter 3 M natriumacetat med pH 5,2. Etter overføring av blandingen til en kolonne som følger med det refererte settet, sentrifuge den ved 17.900 g i 1 minutt ved romtemperatur.Når du har forkastet gjennomstrømningen, plasserer du en spinnkolonne tilbake i samme oppsamlingsrør. Tilsett 750 mikroliter buffer PE som inneholder absolutt etanol til røret. Sentrifuger kolonnen, kast gjennomstrømningen og plasser spinnkolonnen tilbake i samme oppsamlingsrør.Sentrifuger røret, og kast oppsamlingsrøret med gjennomstrømningen. For å amplifisere de transponerte DNA-fragmentene, klargjør PCR-masterblandingen uten å legge til en unik Ad2. n strekkoding primer.Kjør PCR. Kjør kvantitativ PCR eller qPCR. Kontroller amplifikasjonskurvene og identifiser antall ekstra PCR-sykluser som trengs ved å estimere antall sykluser som nådde omtrent 35 % av maksimumet.Bruk beregningene til å kjøre PCR for de resterende 45 mikroliter av PCR-reaksjonen. Ved hjelp av de tidligere prosedyrene, elute de amplifiserte DNA-fragmentene med 20 mikroliter buffer EB. Overfør det eluerte DNA til et nytt PCR-rør og juster volumet til 100 mikroliter ved å tilsette 80 mikroliter buffer EB. Deretter tilsettes 55 mikroliter SPRI-perler og blandes ved pipettering. Etter 5 minutters inkubasjon ved romtemperatur, skille den på et mini magnetisk stativ i 5 minutter.Når du er ferdig, overfør 150 mikroliter av supernatanten til et nytt PCR-rør, tilsett 95 mikroliter SPRI-perler og bland ved pipettering. Inkuber reaksjonen i 5 minutter før du separerer perlene på det magnetiske ministativet. Kast supernatanten forsiktig og vask kulene i 1 minutt med 200 mikroliter 70 % etanol.Gjenta to vasker til. Etter den endelige vasken, sentrifuge rørene ved 1000 G i 1 minutt. Pipett ut den gjenværende etanolen og tørk pelleten ved 37 grader Celsius i 2 minutter på en PCR-maskin med lokket åpent.Når den er tørket, resuspenderes pelleten i 20 mikroliter buffer EB ved pipettering og inkuberer røret i 5 minutter ved romtemperatur. Separer perlene i 5 minutter på minimagnetstativet før du overfører 18 mikroliter av supernatanten som inneholder det endelige biblioteket til et nytt 1,5 milliliter rør. mKirsebærmerkede og GFP-merkede adipocyttkjerner kunne skilles fra de andre celletypekjernene isolert fra fettvevet til en Adipoq-NuTRAP-mus.Avhengig av typen fettdepot er forskjellen ca. 50 % i eWAT, 30 % i iWAT og 65 % i BAT observert i adipocyttfraksjonene. Prøvene som krevde mer enn 15 PCR-sykluser indikerte prøver av lav kvalitet. Størrelsesfordelingsanalysen av ATAC-seq-bibliotekene viste flere topper som tilsvarer den nukleosomfrie regionen, eller NFR, og mono-, di- og multinukleosomer med gjennomsnittlige størrelser på ca. 500 til 800 basepar.Prøver av dårlig kvalitet viste typisk for det meste NFR med ingen eller få nukleosomale topper. Kvalitetskontrolltestene ved qRT-PCR-analysen viste 10 til 20 ganger anrikninger med de positive genomiske elementene nær adipocyttmarkørgener som Adipoq, Fabp4, Plin1 og Pnpla2, mens ingen anrikning ble vist med den negative kontrollen. Anrikningen med det termogene genet Ucp1 ble observert spesifikt i BAT.Mitokondrieavlesningene var mindre enn 2 % og fraksjonen under toppene var ca. 18 % til 44 %Flere sterke topper med høye signal-støy-forhold ble avslørt nær adipocyttmarkørgener som Adipoq, Fabp4 og Plin1 fra alle fettdepotene. Sterke ATAC-seq-topper ble observert ved den brune adipocyttmarkøren Ucp1 locus i BAT-prøven. Den mest kritiske faktoren for denne protokollen er kjernekvalitet.Det er viktig å bruke vevsprøver av høy kvalitet og forsiktig håndtere kjernene gjennom hele forsøket, spesielt under resuspendering etter sentrifugering og sortering. Det er viktig å huske at denne protokollen er avhengig av transgene reportermus med kjernefysisk merking. NuTRAP-mus ble brukt her, men ethvert lignende system kan brukes.Med våre FACS-data kan man utføre beregningsmessig multippel analyse for å finne viktige transkriptomiske faktorer som regulerer genuttrykk i biologiske omgivelser.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Metyl-binding DNA-fangst Sekvense for Pasientservietter

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Flow-sortering og Exome Sequencing av Reed-Sternberg-cellene av klassisk Hodgkin-lymfom

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Encellede Gene Expression Profilering hjelp FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høy oppløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila embryoer og vev med Tyramide Signal forsterkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Kartlegging genomet hele tilgjengelig Chromatin i primære menneskelige T-lymfocytter av ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generering av en gen-forstyrret Streptococcus mutans belastning uten Gene kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

Generere transgene planter med enkelt-kopi innsettinger bruker BIBAC-GW binære vektor

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Chromatin Immunoprecipitation av Murine brun fettvev

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

En fluorescens-basert metode å studere bakteriell Gene regulering i infiserte vev

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...