Name: adipocyte-specific atac-seq with adipose tissues using fluorescence-activated nucleus sorting
Uploaded: 2023-03-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting at JoVE.com

Detta arbete stöddes av IUSM Showalter Research Trust Fund (till H.C.R.), ett IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (till H.C.R.), National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 till H.C.R.) och American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 till H.C.R.).

Djurvård och experiment utfördes enligt förfaranden som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee of Indiana University School of Medicine.
1. Förberedelser innan experimentet påbörjas
<ol><li>Vävnad förberedelse<ol><li>För märkning av adipocytkärna, korsa NuTRAP-möss med adipocytspecifika adiponektin-Cre-linjer (Adipoq-Cre) för att generera Adipoq-NuTRAP-möss, som är hemizygota för både Adipoq-Cre och NuTRAP.</li>
		<li>Dissekera fettvävnade...

<ol>
	<li>Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+Adipocyte+biology.+Adipose+tissue+function+and+plasticity+orchestrate+nutritional+adaptation.">Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation.</a> Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).</li><li>Bielczyk-Maczynska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+adipocyte+plasticity+in+physiology+and+disease.">White adipocyte plasticity in physiology and disease.</a> Cells. 8 (12), 1507 (2019).</li><li>Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipogenic+transcriptome+profiling+using+high+throughput+technologies.">Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies.</a> Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).</li><li>Esteve Rafols, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+Cell+heterogeneity+and+functional+diversity.">Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity.</a> Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).</li><li>Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+white+adipose+tissue:+Molecular+basis+and+clinical+implications.">Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications.</a> Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo.">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocytes+fail+to+maintain+cellular+identity+during+obesity+due+to+reduced+PPAR&#947;+activity+and+elevated+TGF&#946;-SMAD+signaling.">Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPAR&#947; activity and elevated TGF&#946;-SMAD signaling.</a> Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Warming+induces+significant+reprogramming+of+beige,+but+not+brown,+adipocyte+cellular+identity.">Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity.</a> Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+analysis+in+human+early+development+reveals+epigenetic+transition+during+ZGA.">Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA.</a> Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).</li><li>Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+dissection+of+diverse+mouse+adipose+depots.">Identification and dissection of diverse mouse adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).</li><li>So, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cAMP+activation+induces+adipocyte+browning+through+discordant+biphasic+remodeling+of+transcriptome+and+chromatin+accessibility.">Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility.</a> Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).</li><li>Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+GFP-tagged+nuclei+from+frozen+livers+of+INTACT+mice+for+RNA-+and+ATAC-sequencing.">Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).</li><li>Heyward, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genomic+analysis+of+AgRP+neurons+reveals+that+IRF3+regulates+leptin's+hunger-suppressing+effects.">Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects.</a> bioRxiv. , (2022).</li></ol>

I detta dokument har vi presenterat ett optimerat ATAC-seq-protokoll för att bedöma adipocytspecifik kromatintillgänglighet in vivo. Detta ATAC-seq-protokoll som använder Adipoq-NuTRAP-musen genererade framgångsrikt adipocytspecifika kromatintillgänglighetsprofiler. Den mest kritiska faktorn för framgångsrika och reproducerbara ATAC-seq-experiment är kärnkvalitet. Det är viktigt att omedelbart snäppfrysa de dissekerade fettvävnaderna i flytande kväve och förvara dem säkert vid −80 °C utan uppt...

Fettvävnad, som är specialiserad för att lagra överflödig energi i form av lipidmolekyler, är ett nyckelorgan för metabolisk reglering. Den strikta kontrollen av adipocytbildning och underhåll är avgörande för fettvävnadsfunktion och helkroppsenergihomeostas1. Många transkriptionsregulatorer spelar en kritisk roll i kontrollen av adipocytdifferentiering, plasticitet och funktion; Några av dessa regulatorer är inblandade i metaboliska störningar hos människor 2,3. De senaste framstegen inom sekvenseringstekniker med hög genomströmning för genuttryck och epigenomisk analys har ytterligare underlättat upptäckten av de molekylära regulatorerna för adipocytbiologi4. Molekylära profileringsstudier med fettvävnad är utmanande att genomföra på grund av heterogeniteten hos dessa vävnader. Fettvävnad består främst av adipocyter, som är ansvariga för fettlagring, men innehåller också olika andra celltyper, såsom fibroblaster, endotelceller och immunceller5. Dessutom förändras fettvävnadens cellulära sammansättning dramatiskt som svar på patofysiologiska förändringar såsom temperatur och näringsstatus6. För att övervinna dessa problem utvecklade vi tidigare en transgen reportermus, kallad Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), som producerar GFP-märkta ribosomer och mCherry-märkta biotinylerade kärnor på ett Cre-rekombinasberoende sätt7. Det dubbla märkningssystemet gör det möjligt att utföra celltypspecifik transkriptomisk och epigenomisk analys med vävnader. Med hjälp av NuTRAP-möss korsade med adipocytspecifika adiponektin-Cre-linjer (Adipoq-NuTRAP) karakteriserade vi tidigare genuttrycksprofiler och kromatintillstånd från rena adipocytpopulationer in vivo och bestämde hur de förändras under fetma 7,8. Tidigare tillät NuTRAP-möss korsade med bruna och beige adipocytspecifika Ucp1-Cre-linjer (Ucp1-NuTRAP) oss att karakterisera den epigenomiska ombyggnaden av den sällsynta termogena adipocytpopulationen, beige adipocyter, som svar på temperaturförändringar9.
ATAC-seq är en allmänt använd analysmetod för att bedöma tillgängligheten av kromatin i hela genomet. Det hyperreaktiva Tn5-transposaset som används i ATAC-seq möjliggör identifiering av öppna kromatinregioner genom att märka sekvenseringsadaptrar i det kromatintillgängliga området av kärnor10. ATAC-seq är en enkel metod, men den ger robusta resultat och är mycket effektiv även med prover med låg inmatning. Det har därmed blivit en av de mest populära epigenomiska profileringsmetoderna och har bidragit till förståelsen av de reglerande mekanismerna för genuttryck inom olika biologiska sammanhang. Sedan det ursprungliga ATAC-seq-protokollet skapades har olika ATAC-seq-härledda tekniker vidareutvecklats för att modifiera och optimera protokollet för olika typer av prover. Till exempel är Fast-ATAC utformad för analys av blodcellsprover11, Omni-ATAC är ett optimerat protokoll för frysta vävnadsprover12 och MiniATAC-seq är effektivt för embryoanalys i tidigt stadium13. Att tillämpa ATAC-seq-metoden på adipocyter, särskilt från vävnadsprover, är dock fortfarande utmanande. Förutom heterogeniteten hos fettvävnad kan dess höga lipidinnehåll störa effektiva rekombinationsreaktioner av Tn5-transposas även efter kärnisolering. Dessutom orsakar det höga mitokondriella innehållet i adipocyter, särskilt i bruna och beige adipocyter, hög mitokondriell DNA-kontaminering och bortkastade sekvensläsningar. Detta dokument beskriver ett protokoll för adipocytspecifik ATAC-seq med hjälp av Adipoq-NuTRAP-möss (figur 1). Genom att dra nytta av fluorescensmärkt kärnsortering möjliggör detta protokoll insamling av rena populationer av adipocytkärnor bort från andra förvirrande celltyper och effektivt avlägsnande av lipider, mitokondrier och vävnadsskräp. Därför kan detta protokoll generera celltypspecifika högkvalitativa data och minimera avfall från mitokondriella läsningar samtidigt som man använder en minskad mängd indata och reagens jämfört med standardprotokollet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adiponectin-Cre mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuTRAP mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>29899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA-LoBind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>86-923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x TD buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>15027866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR plate</td>
			<td>Applied biosystem</td>
			<td>4483285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP reagent (SPRI beads)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear adhesive film</td>
			<td>Applied biosystem</td>
			<td>4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-free distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 side skirted magnet</td>
			<td>Thermo Fishers</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>28719128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBH-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2134015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2 M)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>MT-252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips</td>
			<td>EpiCypher</td>
			<td>10-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>MT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>M0541S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Thermo Fishers</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR 8-tube strip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-4708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Fishers</td>
			<td>78439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green I (10,000x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDE I enzyme</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>15027865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSAria Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fishers</td>
			<td>QuantStudio&#8239;5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adipocyte-specific atac-seq with adipose tissues using fluorescence-activated nucleus sorting

Analys för transposastillgängligt kromatin med sekvensering med hög genomströmning (ATAC-seq) är en robust teknik som möjliggör genomomfattande kromatintillgänglighetsprofilering. Denna teknik har varit användbar för att förstå de reglerande mekanismerna för genuttryck i en rad biologiska processer. Även om ATAC-seq har modifierats för olika typer av prover, har det inte skett några effektiva modifieringar av ATAC-seq-metoder för fettvävnader. Utmaningar med fettvävnader inkluderar den komplexa cellulära heterogeniteten, stort lipidinnehåll och hög mitokondriell förorening. För att övervinna dessa problem har vi utvecklat ett protokoll som tillåter adipocytspecifik ATAC-seq genom att använda fluorescensaktiverad kärnsortering med fettvävnader från den transgena reportern Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus. Detta protokoll producerar högkvalitativa data med minimala bortkastade sekvensläsningar samtidigt som mängden kärninmatning och reagens minskar. Detta dokument innehåller detaljerade steg-för-steg-instruktioner för ATAC-seq-metoden validerad för användning av adipocytkärnor isolerade från musfettvävnader. Detta protokoll kommer att hjälpa till vid undersökning av kromatindynamik i adipocyter vid olika biologiska stimuleringar, vilket möjliggör nya biologiska insikter.

För att analysera fettvävnad med hjälp av detta ATAC-seq-protokoll genererade vi Adipoq-NuTRAP-möss som matades med chow-dieter; vi isolerade sedan adipocytkärnor från epididymal vit fettvävnad (eWAT), inguinal vit fettvävnad (iWAT) och brun fettvävnad (BAT) med hjälp av flödescytometri. De isolerade kärnorna användes för tagmentation, följt av DNA-rening, PCR-amplifiering, kvalitetskontrollsteg, sekvensering och dataanalys, som beskrivits ovan. Syftet med detta representativa experiment var att profilera ...

Watch this Scientific Journal Video about Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting at JoVE.com

Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting

Vi presenterar ett protokoll för analys för transposastillgängligt kromatin med high-throughput sekvensering (ATAC-seq) specifikt på adipocyter med hjälp av kärnsortering med fettvävnad isolerad från transgena reportermöss med nukleär fluorescensmärkning.

Adipocytspecifik ATAC-Seq med fettvävnad med fluorescensaktiverad kärnsortering

Assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a robust technique that enables genome-wide chromatin ...

ATAC-seq är en kraftfull teknik för att förstå regleringsmekanismer för genuttryck. Fettvävnad är dock svår att använda denna teknik på grund av dess stora lipidinnehåll, hög mitokondriell förorening och cellulär heterogenitet. I detta protokoll utfördes adipocytspecifik ATAC-sekvensering med hjälp av fluorescensaktiverad kärnsortering, vilket genererar högkvalitativa data med minimal mitokondriell DNA-kontaminering.Denna metod kan också användas i andra vävnader där celltypspecifika Cre-muslinjer finns tillgängliga med nukleär märkning av transgena rapportlinjer. Börja kärnisoleringen genom att kyla glaset Dounce homogenisatorer på is med ett glas Dounce per prov. Tillsätt sedan 7 ml NPB-blandningen till varje glas Dounce.Lägg sedan 50 till 100 milligram fryst fettvävnad i glaset Dounce och skär det i några mindre bitar med en lång sax. Stroke 10 gånger med en lös stöt för alla prover, och sedan 10 gånger med en tät pestel. Filtrera innehållet genom en sil på 100 mikrometer till ett nytt 50 ml-rör innan de filtrerade homogenaten överförs till ett 15 ml-rör för centrifugering.Efter avlägsnande av supernatanten, återsuspendera pelleten i 500 mikroliter PBS-N genom försiktig men noggrann fingerknackning. Filtrera sedan suspensionen genom en 40 mikrometer sil i ett 50 ml rör och skölj silen med 250 mikroliter PBS-N. Överför den filtrerade kärnsuspensionen till ett fluorescensaktiverat cellsorterings- eller FACS-rör med hjälp av en mikropipett.Förbered uppsamlingsröret genom att tillsätta 500 mikroliter PBS-N till det nya 1,5 milliliterröret och invertera det några gånger för att blöta alla inre ytor med bufferten. Snurra rören kort för att få ner all vätska innan du lägger dem på is tills de sorteras. För FACS använder du FSC-A/FSC-H-grinden för singlets och FSC-A/SSC-A för borttagning av små eller stora skräp.Grind för mCherry / GFP-positiv adipocytkärnpopulation, och samla 10 000 kärnor i varje uppsamlingsrör som förberetts tidigare. För eftersortering av kärnberedning, tillsätt 500 mikroliter PBS-N till varje uppsamlingsrör och blanda det genom att invertera röret några gånger innan uppsamlingsrören centrifugeras vid 200 G i 10 minuter vid 4 grader Celsius. Ta bort supernatanten helt.För att framställa 25 mikroliter Tn5-masterblandning, blanda 12,5 mikroliter 2x tagmentations-DNA-buffert eller TD-buffert, 1,25 mikroliter Tn5-transposas eller TDE I-enzym och 11,25 mikroliter nukleasfritt vatten. Tillsätt sedan 25 mikroliter Tn5-masterblandning till varje kärnpellet och resuspendera den genom försiktig pipettering. Inkubera vid 600 varv / min i 30 minuter vid 37 grader Celsius med en termisk mixer.Tillsätt 25 mikroliter nukleasfritt vatten till 25 mikroliter av blandningen av Tn5-kärnresuspension, vilket ger den slutliga volymen 50 mikroliter. Tillsätt sedan 250 mikroliter buffert PB och 5 mikroliter 3 M natriumacetat med pH 5,2. Efter överföring av blandningen till en kolonn försedd med det refererade kitet, centrifugera den vid 17 900 G i 1 minut vid rumstemperatur.När du har kastat genomströmningen, placera en snurrkolonn tillbaka i samma uppsamlingsrör. Tillsätt 750 mikroliter buffert PE innehållande absolut etanol till röret. Centrifugera kolonnen, kassera genomströmningen och sätt tillbaka rotationskolonnen i samma uppsamlingsrör.Centrifugera röret och kassera uppsamlingsröret med genomströmningen. För att förstärka de transponerade DNA-fragmenten, förbered PCR-masterblandningen utan att tillsätta en unik Ad2. n streckkodning primer.Kör PCR. Kör kvantitativ PCR eller qPCR. Kontrollera förstärkningskurvorna och identifiera antalet ytterligare PCR-cykler som behövs genom att uppskatta antalet cykler som nådde cirka 35% av det maximala.Använd beräkningarna för att köra PCR för de återstående 45 mikroliter av PCR-reaktionen. Använd de tidigare procedurerna, eluera de förstärkta DNA-fragmenten med 20 mikroliter buffert EB. Överför det eluerade DNA:t till ett nytt PCR-rör och justera volymen till 100 mikroliter genom att tillsätta 80 mikroliter buffert EB. Tillsätt sedan 55 mikroliter SPRI-pärlor och blanda genom pipettering. Efter 5 minuters inkubation vid rumstemperatur, separera den på ett minimagnetiskt stativ i 5 minuter.När du är klar, överför 150 mikroliter av supernatanten till ett nytt PCR-rör, tillsätt 95 mikroliter SPRI-pärlor och blanda genom pipettering. Inkubera reaktionen i 5 minuter innan pärlorna separeras på det magnetiska ministativet. Kassera supernatanten försiktigt och tvätta pärlorna i 1 minut med 200 mikroliter 70% etanol.Upprepa ytterligare två tvättar. Efter den slutliga tvätten, centrifugera rören vid 1000 G i 1 minut. Pipettera ut resterande etanol och torka pelletsen vid 37 grader Celsius i 2 minuter på en PCR-maskin med locket öppet.När den har torkats, suspendera pelleten i 20 mikroliter buffert EB genom pipettering och inkubera röret i 5 minuter vid rumstemperatur. Separera pärlorna i 5 minuter på det magnetiska ministativet innan du överför 18 mikroliter av supernatanten som innehåller det slutliga biblioteket till ett nytt 1,5 milliliterrör. mCherry-märkta och GFP-märkta adipocytkärnor kunde särskiljas från de andra celltypkärnorna isolerade från fettvävnaderna i en Adipoq-NuTRAP-mus.Beroende på typen av fettdepå observerades skillnaden på cirka 50 % i eWAT, 30 % i iWAT och 65 % i BAT i adipocytfraktionerna. De prover som krävde mer än 15 PCR-cykler indikerade prover av låg kvalitet. Storleksfördelningsanalysen av ATAC-seq-biblioteken visade flera toppar motsvarande den nukleosomfria regionen, eller NFR, och mono-, di- och multinukleosomer med genomsnittliga storlekar på cirka 500 till 800 baspar.Prover av dålig kvalitet visade vanligtvis mestadels NFR med inga eller få nukleosomala toppar. Kvalitetskontrolltesterna med qRT-PCR-analysen visade 10 till 20-faldiga anrikningar med de positiva genomiska elementen nära adipocytmarkörgener såsom Adipoq, Fabp4, Plin1 och Pnpla2, medan ingen anrikning visades med den negativa kontrollen. Anrikningen med den termogena genen Ucp1 observerades specifikt i BAT.Mitokondriella avläsningar var mindre än 2% och fraktionen under topparna var cirka 18% till 44% Flera starka toppar med höga signal-brusförhållanden avslöjades nära adipocytmarkörgener som Adipoq, Fabp4 och Plin1 från alla fettdepåer. Starka ATAC-seq-toppar observerades vid den bruna adipocytmarkören Ucp1-lokus i BAT-provet. Den mest kritiska faktorn för detta protokoll är kärnkvalitet.Det är viktigt att använda högkvalitativa vävnadsprover och att försiktigt hantera kärnorna under hela experimentet, särskilt under resuspension efter centrifugering och sortering. Det är viktigt att komma ihåg att detta protokoll bygger på transgena reportermöss med kärnmärkning. NuTRAP-möss användes här, men alla liknande system kan användas.Med våra FACS-data kan man utföra beräkningsmultipelanalys för att hitta viktiga transkriptomiska faktorer som reglerar genuttryck i biologiska miljöer.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Metyl-bindande DNA fånga sekvensering för patientvävnader

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Flödessortering och Exome-sekvensering av Reed-Sternberg-cellerna av klassisk Hodgkin-lymfom

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Encelliga profilering av genuttryck med FACS och qPCR med interna standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hög upplösning fluorescerande In Situ hybridisering i Drosophila embryon och vävnader med Tyramide Signal förstärkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Mappning av Genome-wide tillgängliga kromatin i primära humana T-lymfocyter av ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation av en gen-stört Streptococcus mutans stam utan genen kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

Generera transgena växter med singel-kopia infogningar använder BIBAC-GW binära vektor

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Kromatin Immunoprecipitation av murina Brun fettvävnad

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

En fluorescens-baserad metod för att studera bakteriell genreglering i infekterade vävnader

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...