Name: automated multimodal stimulation and simultaneous neuronal recording from multiple small organisms
Uploaded: 2023-03-03T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms at JoVE.com

We bedanken Fox Avery voor het testen van deze protocollen en het beoordelen van het manuscript en Eric Hall voor programmeerhulp. Financiering voor de hierin gepresenteerde methoden werd gedeeltelijk verstrekt door de National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).

1. Neurale beeldvormingsapparatuur
OPMERKING: Zie Lawler en Albrecht15 voor gedetailleerde instructies over het bouwen van het beeldvormings- en stimulatiesysteem, dat de timing van de microscoopverlichting, beeldacquisitie en stimulusafgifte regelt (figuur 1). Een goedkope Arduino Nano-stimulusregelaar bedient de vloeistofkleppen via digitale signalen naar een klepregelaar en regelt de optogenetische verlichting via analoge ...

<ol>
	<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).</li><li>Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+calcium+sensor+proteins+for+monitoring+neural+activity.">Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity.</a> Neurophotonics. 1, 025008 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).</li><li>Larsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circuit+for+gradient+climbing+in+C.+elegans+chemotaxis.">A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis.</a> Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).</li><li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+fluid+delivery+from+multiwell+plates+to+microfluidic+devices+for+high-throughput+experiments+and+microscopy.">Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 6217 (2018).</li><li>Schr&#246;del, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Lawler, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+analysis+in+adult+C.+elegans+reveals+state-dependent+alteration+of+neural+and+behavioral+responses.">Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).</li><li>Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+adapted+microfluidic+olfactory+chip+for+the+imaging+of+neuronal+activity+in+response+to+pheromones+in+male+C.+elegans+head+neurons.">Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polymer+index-matched+to+water+enables+diverse+applications+in+fluorescence+microscopy.">A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy.</a> Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).</li><li>Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+behavioral+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+in+precise+spatiotemporal+chemical+environments.">High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments.</a> Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Cohen, R. A., Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Inhibition.">Temporal Inhibition.</a> Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. , 2480-2481 (2011).</li><li>Lawler, D. E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+neural+activity+during+sleep/wake+events+in+adult+C.+elegans+by+automated+sleep+detection+and+stimulation.">Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).</li><li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+methods+of+microscope+control+using+&#181;Manager+software.">Advanced methods of microscope control using &#181;Manager software.</a> Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).</li><li>Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+behavioral+analysis,+microscopy,+and+neuronal+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).</li><li>NeuroTracker. GitHub Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/albrechtLab/Neurotracker">https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</a> (2022)</li><li>NeuroTracker User Guide. GitHub Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/albrechtLab/Neurotracker">https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</a> (2022)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Galotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+triggers+calcium-mediated+immune+response+in+the+plant+model+Physcomitrella+patens.">Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).</li><li>Qian, X., Song, H., Ming, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+organoids:+Advances,+applications+and+challenges.">Brain organoids: Advances, applications and challenges.</a> Development. 146 (8), 166074 (2019).</li><li>Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+synaptic+signaling,+regulation,+and+plasticity+distinguish+two+classes+of+C.+elegans+glutamatergic+neurons.">Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons.</a> eLife. 6, 31234 (2017).</li><li>Boulin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+fusions.">Reporter gene fusions.</a> WormBook. , (2006).</li></ol>

In dit protocol beschrijven we een open-access microscopiesysteem voor de beoordeling van neurale activiteitsverschijnselen met behulp van de temporeel nauwkeurige levering van verschillende stimuluspatronen. Het microfluïdische platform levert herhaalbare stimuli terwijl het tientallen dieren in het gezichtsveld van de microscoop houdt. Weinig commerciële microscopiesoftwarepakketten maken het eenvoudig programmeren van verschillende stimulustimingpatronen mogelijk, en degenen die dat wel doen, vereisen vaak de handma...

Calciumbeeldvormingstechnieken hebben de niet-invasieve registratie van in vivo neurale dynamiek in realtime mogelijk gemaakt met behulp van fluorescentiemicroscopie en genetisch gecodeerde calciumindicatoren uitgedrukt in doelcellen 1,2,3. Deze sensoren gebruiken meestal een groen fluorescerend eiwit (GFP), zoals de GFP-calmodulin-M13 peptide (GCaMP) familie, om de fluorescentie-intensiteit te verhogen bij neuronale activering en verhoogde intracellulaire calciumspiegels. Calciumbeeldvorming is vooral krachtig geweest in de nematode C. elegans voor het onderzoeken hoe neuronen en neurale circuits functioneren in levende, zich gedragende dieren 4,5,6,7,8,9,10, omdat hun transparante aard betekent dat er geen chirurgisch proces nodig is voor optische toegang, en celspecifieke genpromotors richten zich op expressie naar de cellen van belang. Deze technieken maken vaak gebruik van microfluïdische apparaten, die nauwkeurig gecontroleerde omgevingen bieden om biologische, chemische en fysische verschijnselen op kleine fysieke schaal te bestuderen11,12. Microfluïdische apparaten zijn er in overvloed voor het meten van neurale activiteit, met nieuwe ontwerpen die voortdurend in ontwikkeling zijn, en ze worden gemakkelijk vervaardigd in het onderzoekslaboratorium. Veel ontwerpen vangen echter één dier tegelijk, waardoor de experimentele doorvoer 7,9,13 wordt beperkt. Neurale reacties variëren vaak aanzienlijk tussen dieren als gevolg van verschillen in eerdere ervaring, interne toestanden zoals stress of honger, of stochastische factoren zoals genexpressieniveaus. Deze verschillen creëren een behoefte aan methoden die tegelijkertijd veel dieren kunnen stimuleren en observeren en informatie van individuen kunnen extraheren4.
Bovendien worden bepaalde neuromodulerende verschijnselen alleen duidelijk onder specifieke stimulatieomstandigheden, zoals temporele remming14, die verwijst naar de korte onderdrukking van reacties wanneer stimulatie snel achter elkaar plaatsvindt. Elektrofysiologische systemen kunnen voor dit doel neurale activiteit over een brede stimulusruimte sturen, waarbij bijvoorbeeld de elektrische pulsstroom, spanning, frequentie, golfvorm, duty cycle en timing van periodieke stimulustreinen worden gemoduleerd. Indirecte stimulatie door natuurlijk gedetecteerde stimuli of optogenetische systemen zou baat hebben bij een vergelijkbare breedte van controlemechanismen. Momenteel worden veel natuurlijke stimuli gepresenteerd op een eenvoudige "aan-uit" manier, zoals geurpresentatie en -verwijdering, met behulp van commerciële systemen die traag zijn geweest om flexibiliteit toe te voegen. Goedkope microcontrollers kunnen nu echter de levering van verschillende soorten stimuli automatiseren op een manier die kan worden aangepast aan de behoeften van de onderzoekers. In combinatie met microfluïdica hebben deze systemen het doel bereikt van verhoogde experimentele doorvoer en flexibiliteit, waardoor neurale reacties op een verscheidenheid aan nauwkeurige stimuli tegelijkertijd kunnen worden gemeten bij veel dieren 4,6. Multimodale stimulatie kan worden gebruikt om het neuronale circuit verder te ondervragen, bijvoorbeeld door veranderingen in neurale prikkelbaarheid te volgen bij consistent stimuleren voor, tijdens en na een orthogonale verstoring zoals blootstelling aan geneesmiddelen4. De voordelen van goedkope, open microscopiesystemen zijn duidelijk voor het bevorderen van wetenschappelijk onderzoek, maar in de praktijk kan de behoefte aan onderdeelinkoop, constructie en prestatievalidatie de adoptie van deze technieken belemmeren.
Dit protocol is bedoeld om een aantal van deze technische uitdagingen te verlichten. Terwijl eerdere protocollen zich richtten op het gebruik van microfluïdische apparaten en basisstimulatie 9,15,17, beschrijven we hier de constructie en het gebruik van een flexibel, geautomatiseerd, multimodaal stimulusafgiftesysteem voor neurale beeldvorming in C. elegans of andere kleine organismen met behulp van eerder beschreven microfluïdische apparaten4. Het open-source systeem is geprogrammeerd via eenvoudige tekstbestanden om de experimenten te definiëren, en het NeuroTracker data-analyseprogramma extraheert semi-automatisch de neurale activiteitsgegevens uit de microscoopvideo's. We demonstreren dit systeem met voorbeelden van het beoordelen van temporele remming, ontremming en stimulus crosstalk met behulp van het chemosensorische neuron AWA, dat depolariseert als reactie op verschillende voedselgeuren of als reactie op licht bij het tot expressie brengen van optogenetische lichtgevoelige ionkanalen 5,6.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.&#160;coli (OP50)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>Cat# OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental models: Organisms/strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.&#160;elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work</td>
			<td>NZ1091, for example</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B85307</td>
			<td>diacetyl, example chemical stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein, Sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass water repellant</td>
			<td>Rain-X</td>
			<td>Cat #800002250</td>
			<td>glass hydrophobic treatment (single-use)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium (NGM) agar</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>Cat #: 20-273NGM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60&#160;mm)</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>Cat #T3305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184</td>
			<td>Dow Chemical</td>
			<td>Cat# 1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS)</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>CAS# 78560-45-9</td>
			<td>glass hydrophobic treatment (durable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino IDE</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>https://www.arduino.cc/en/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Albrecht Lab</td>
			<td>https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotracker data analysis software</td>
			<td>Albrecht Lab</td>
			<td>https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Microscope and Stimulation System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5&#215; objective or similar)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Cat #491237-0012-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>Cat #XYLIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Cat #C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino nano</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>Cat #A000005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12)</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Cat #LQX12-3W24FF48-000</td>
			<td>Valve 1: Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-way normally-closed (NC) Pinch Valve</td>
			<td>Bio-Chem Valve Inc</td>
			<td>Cat #075P2-S432</td>
			<td>Valve 2: Outflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way Pinch Valve</td>
			<td>NResearch</td>
			<td>Cat #161P091</td>
			<td>Valve 3: Stimulus selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm)</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveLink 8.2 digital/manual valve controller</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>Cat #01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wires and connectors</td>
			<td>various</td>
			<td>See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Device Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel variable speed rotary cutter 4000&#160;</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #F0134000AB</td>
			<td>Set speed to 5k RPM for cutting glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel drill press rotary tool workstation</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #220-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond drill bit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #7134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide, 1&#160;mm thick</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat #75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scribe (Diamond scriber)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>Cat #54468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer 3-way stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Cat #EW-30600-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer 23 G blunt needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat #89134-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device</td>
			<td>Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device clamp</td>
			<td>Warner Instruments (or machine shop)</td>
			<td>P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic tubing, 0.02&#8243; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Cat #EW-06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 19 G, 0.5&#8243;</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>Cat #NE-1027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated multimodal stimulation and simultaneous neuronal recording from multiple small organisms

Fluorescerende genetisch gecodeerde calciumindicatoren hebben sterk bijgedragen aan ons begrip van neurale dynamica van het niveau van individuele neuronen tot hele hersencircuits. Neurale reacties kunnen echter variëren als gevolg van eerdere ervaring, interne toestanden of stochastische factoren, waardoor de behoefte aan methoden ontstaat die de neurale functie bij veel individuen tegelijk kunnen beoordelen. Terwijl de meeste opnametechnieken een enkel dier tegelijk onderzoeken, beschrijven we het gebruik van breedveldmicroscopie om neuronale opnames op te schalen naar tientallen Caenorhabditis elegans of andere organismen op submillimeterschaal tegelijk. Open-source hardware en software bieden grote flexibiliteit bij het programmeren van volledig geautomatiseerde experimenten die de intensiteit en timing van verschillende soorten stimulus regelen, waaronder chemische, optische, mechanische, thermische en elektromagnetische stimuli. In het bijzonder bieden microfluïdische stroomapparaten nauwkeurige, herhaalbare en kwantitatieve controle van chemosensorische stimuli met een tijdsresolutie van minder dan een seconde. De NeuroTracker semi-geautomatiseerde data-analysepijplijn extraheert vervolgens individuele en populatiebrede neurale reacties om functionele veranderingen in neurale prikkelbaarheid en dynamiek te ontdekken. Dit artikel presenteert voorbeelden van het meten van neuronale aanpassing, temporele remming en stimulus crosstalk. Deze technieken verhogen de precisie en herhaalbaarheid van stimulatie, maken de verkenning van populatievariabiliteit mogelijk en zijn generaliseerbaar naar andere dynamische fluorescerende signalen in kleine biosystemen van cellen en organoïden tot hele organismen en planten.

We presenteren verschillende voorbeelden van stimuluspatronen die verschillende neurale verschijnselen beoordelen, waaronder temporele remming, aanpassing en ontremming. Temporele remming is de kortstondige onderdrukking van een neurale respons op een tweede stimuluspresentatie die kort na de eerste presentatie optreedt14. Om dit fenomeen te testen, werden in een paarpulsexperiment acht patronen gepresenteerd die bestonden uit twee 1 s odorantpulsen gescheiden door een interval va...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms at JoVE.com

Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms

We presenteren een methode voor de flexibele chemische en multimodale stimulatie en registratie van gelijktijdige neurale activiteit van veel Caenorhabditis elegans-wormen . Deze methode maakt gebruik van microfluïdica, open-source hardware en software en gecontroleerde geautomatiseerde gegevensanalyse om de meting van neuronale verschijnselen zoals aanpassing, temporele remming en stimulusoverspraak mogelijk te maken.

Geautomatiseerde multimodale stimulatie en gelijktijdige neuronale opname van meerdere kleine organismen

Fluorescent genetically encoded calcium indicators have contributed greatly to our understanding of neural dynamics from the level of individual neurons ...

Neurale reacties geven inzicht in hersenactiviteit, maar kunnen variëren tussen experimenten en individuen. Dit protocol helpt door het automatiseren van stimulatieregistratie en -analyse en het vereenvoudigen van het programmeren van verschillende soorten en patronen van stimuli. De geautomatiseerde techniek maakt opnames mogelijk voor meerdere neuronen en organismen in hetzelfde microfluïdische formaat parallel.Dit verbetert de herhaalbaarheid van opnames en maakt het mogelijk om neuronale variabiliteit tussen populaties te verkennen. Verschillende stimulatiepatronen zijn nodig om neurale verschijnselen zoals aanpassing en sensorische integratie te onthullen. Deze methode is generaliseerbaar naar andere dynamische signalen van cellen en organoïden naar organismen en planten.Zet om te beginnen de microscoop aan, vul en verwijder de luchtbellen uit de reservoirslang met behulp van de primingspuit en vul vervolgens de uitstroomslang met buffer. Verwijder het microfluïdische apparaat uit de vacuüm exsiccator. Plaats het apparaat op de microscoop en plaats snel de uitlaatslang.Druk zachtjes op de uitlaatspuit om vloeistof in het apparaat te injecteren totdat er een druppel uit een inlaat komt. Gebruik bij deze druppelvormige inlaat een drop-to-drop-verbinding om de overeenkomstige vloeistofinlaatbuis in te brengen, zodat er vloeistofdruppels aanwezig zijn op zowel de inlaatslang als de patrijspoort van het apparaat om te voorkomen dat een bel wordt geïntroduceerd. Sluit de volgende inlaatbuis aan op de volgende druppel.Injecteer indien nodig meer vloeistof uit de uitlaat en herhaal dit totdat alle inlaten zijn gevuld. Plaats een stevige blokkeringspen bij ongebruikte inlaten en de wormlaadpoort. Controleer de stroom op het scherm om er zeker van te zijn dat de stroom in de gewenste richting gaat.Draai klep één op de klepregelaar en observeer de stimulusstroom die in de microfluïdische arena stroomt. Als de stroom uit balans is, past u de reservoirhoogten aan. Breng de jongvolwassen dieren over op een ongezaaid nematodengroeimedium of NGM-agarplaat met behulp van een draadpuntprikker en overspoel de plaat vervolgens met ongeveer vijf milliliter van één XS-basale buffer, zodat de dieren kunnen zwemmen.Zuig de wormen op in een laadspuit van één tot drie milliliter met behulp van de bijgevoegde slang die is voorgevuld met één XS-basale buffer. Beweeg met behulp van een stereoscoop de slang met één hand onder het vloeistofoppervlak naar elk gewenst dier en trek deze in de slang met behulp van de spuit in de andere hand. Sluit de omtrek van de uitlaat, verwijder de wormlaadpen en sluit de wormlaadspuit aan op het apparaat met behulp van een drop-to-drop-verbinding.Laat de dieren vervolgens zachtjes de arena in stromen. Stel een bufferstroom in en laat maximaal een uur immobilisatie door tetramisol instellen. Maak met de teksteditor een stimulusdefinitietekstbestand met de naam userdefinedacquisitionsettings.txt met de stimulatie-instellingen voor de geautomatiseerde beeldacquisitie. Dit bestand definieert microscoopacquisitieparameters zoals belichtings- en excitatietiming, studieduur, intervallen en opslagmap. Het definieert ook het experimenttype en de instellingen voor stimulatietiming.Gebruik voor een enkel stimulusexperiment een indeling met slechts één herhaalde stimulatieopdracht. Gebruik voor een experiment met meerdere patronen een indeling met meerdere stimulatieopdrachten door een patroonreeks cijfers op te nemen die de volgorde van de stimuluspatronen vertegenwoordigt. Voer voor elk patroon een stimulatieopdracht in op een afzonderlijke regel.Voer vervolgens de microscoopbesturingssoftware uit. Controleer of alle vloeistofinlaten open zijn, de stroom gewenst is in de arena en de neuronen van belang in focus zijn binnen het live-venster. Sluit vervolgens het live-venster en voer het script multipatternrunscript uit.BSH binnen de software. Om de gegevens te analyseren, voert u NeuroTracker uit door achtereenvolgens op plug-ins te klikken, vervolgens op tracking en vervolgens op NeuroTracker. Selecteer de map met de tiff-videobestanden die moeten worden bijgehouden en selecteer het bereik van de bestanden die moeten worden verwerkt.Open vervolgens met behulp van de afbeelding en pas menu's de helderheidscontrast- en drempelregelvensters open. Controleer de donkere achtergrond en stel het bereik niet opnieuw in in het drempelvenster, waarbij u de drempelmethode instelt op standaard en de visualisatie op rood. Klik vervolgens op automatisch in het helderheidscontrastvenster voor neuronzichtbaarheid.Pas in het helderheidscontrastvenster de minimale en maximale schuifregelaars aan totdat de neuronen duidelijk te onderscheiden zijn. Pas vervolgens het drempelniveau aan totdat alle neuronen verschijnen als kleine rode vlekken gescheiden van andere objecten. Pas de frameschuifregelaar aan om de beweging en intensiteitsveranderingen van het neuron te observeren, waarbij u merkt dat dieren moeten worden uitgesloten van tracking, bijvoorbeeld vanwege overlap met andere dieren.Na het identificeren van de neuronen voor tracking, past u indien nodig het drempelniveau voor elk dier aan, zodat het rode drempelgebied boven het neuron in elk frame zichtbaar is. Klik op het neuron om de positie en het drempelniveau vast te leggen. Wanneer alle neuronen zijn geselecteerd, drukt u op de spatiebalk om te beginnen met volgen.Bewaak het volgproces voor elk dier en breng de nodige correcties aan. Als NeuroTracker pauzeert, verliest het het neuron. Pas het drempelniveau indien nodig aan en klik opnieuw op het neuron.Als het integratievak naar een andere nabijgelegen dierlijke of niet-neuronale structuur springt, drukt u op de spatiebalk om te pauzeren. Verplaats de schuifregelaar terug naar het eerste foutieve frame en klik opnieuw op de juiste neuronlocatie. Voer de neurotrackersummarypdf uit.m in MATLAB en selecteer de map met de NeuroTracker-gegevenstekstbestanden. Wacht tot er een overzichts-PDF wordt gegenereerd, zodat het trackingproces kan worden geverifieerd. De dieren kunnen worden geïdentificeerd aan de hand van de aantallen en de neurale reacties van elk dier en elke proef en kunnen worden bekeken om de populatievariabiliteit te beoordelen.Gebruik de functie databrowse. m om de neurale gegevens te verkennen, gegroepeerd op proefnummer, diernummer, stimulatiepatroon of op een andere categorie. Het temporele remmingsfenomeen werd getest in een gepaard pulsexperiment dat acht patronen produceerde die bestonden uit twee geurpulsen van één seconde, gescheiden door een interval variërend van nul tot 20 seconden.De eerste geurpuls van één seconde veroorzaakte een gelijke responsgrootte in de diacetyl die AWA-neuronen detecteerde en reacties in de tweede puls varieerden met het interstimulusinterval. Ontremming werd beoordeeld door het catch trial experiment waarbij aanpassing aan de diacetylstimulus werd waargenomen, maar de presentatie van de nieuwe 2-methylpyrazine stimulus veroorzaakte geen sterk ontremmingseffect. De geteste multimodale stimulatie toonde aan dat chemische stimulatie alleen aanpassing veroorzaakte, terwijl optische stimulatie alleen dat niet deed.Het gecombineerde multimodale stimuluspatroon toonde echter aan dat optogene responsen gevoelig waren voor chemisch geïnduceerde aanpassing. Door het microfluïdische ontwerp aan te passen om twee arena's op te nemen, kunnen we genetische of andere verstoringen tegelijkertijd vergelijken met een gematchte referentie. Eenmaal ingesteld, kan het systeem op vele manieren worden gewijzigd.We hebben bijvoorbeeld automatisch chemische dosisresponsen en toestandsafhankelijke veranderingen in neurale activiteit gemeten, zoals tussen slaap- en waaktoestanden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Design and Construction of a Cost Effective Headstage for Simultaneous Neural Stimulation and Recording in the Water Maze

Ontwerp en Bouw van een kosteneffectieve Headstage voor Simultaneous neurale stimulatie en opnemen in het Water Maze

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial ...

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Geautomatiseerde Sholl Analyse van Gedigitaliseerde Neuronale morfologie op meerdere schalen

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Gelijktijdig opnemen van Calcium Signalen van geïdentificeerde neuronen en eetgedrag van de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

Een Volledig geautomatiseerd en zeer veelzijdige systeem voor het testen van meerdere cognitieve functies en opnemen Neuronale Activiteiten in Knaagdieren

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Gelijktijdig Pre-en post-synaptische Elektrofysiologische Opnemen vanaf<em&gt; Xenopus</em&gt; Zenuw-spier Co-culturen

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

Deep Brain Stimulation met gelijktijdige fMRI in Knaagdieren

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Gelijktijdige Langdurige Recordings op Twee Neuronale Processing Fasen in Behaving Honingbijen

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Goud nanorod-bijgestaan ​​Optische Stimulatie van neuronale cellen

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats

Gelijktijdig opnemen van Electroretinografie en Visual evoked potentials in verdoofde ratten

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the ...