Name: automated multimodal stimulation and simultaneous neuronal recording from multiple small organisms
Uploaded: 2023-03-03T14:10:00
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これらのプロトコルをテストし、原稿をレビューしてくれたFox Avery と、プログラミングの支援をしてくれた Eric Hall に感謝します。ここに提示された方法のための資金は、全米科学財団1724026(D.R.A.)によって部分的に提供された。

1. 神経画像機器
注:顕微鏡の照明タイミング、画像取得、および刺激の送達を制御するイメージングおよび刺激システムの構築に関する詳細な手順については、LawlerおよびAlbrecht15を参照してください(図1)。安価なArduino Nano刺激コントローラーは、バルブコントローラーへのデジタル信号を介して流体バルブを作動させ、...

<ol>
	<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).</li><li>Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+calcium+sensor+proteins+for+monitoring+neural+activity.">Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity.</a> Neurophotonics. 1, 025008 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).</li><li>Larsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circuit+for+gradient+climbing+in+C.+elegans+chemotaxis.">A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis.</a> Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).</li><li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+fluid+delivery+from+multiwell+plates+to+microfluidic+devices+for+high-throughput+experiments+and+microscopy.">Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 6217 (2018).</li><li>Schr&#246;del, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Lawler, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+analysis+in+adult+C.+elegans+reveals+state-dependent+alteration+of+neural+and+behavioral+responses.">Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).</li><li>Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+adapted+microfluidic+olfactory+chip+for+the+imaging+of+neuronal+activity+in+response+to+pheromones+in+male+C.+elegans+head+neurons.">Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polymer+index-matched+to+water+enables+diverse+applications+in+fluorescence+microscopy.">A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy.</a> Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).</li><li>Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+behavioral+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+in+precise+spatiotemporal+chemical+environments.">High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments.</a> Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Cohen, R. A., Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Inhibition.">Temporal Inhibition.</a> Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. , 2480-2481 (2011).</li><li>Lawler, D. E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+neural+activity+during+sleep/wake+events+in+adult+C.+elegans+by+automated+sleep+detection+and+stimulation.">Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).</li><li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+methods+of+microscope+control+using+&#181;Manager+software.">Advanced methods of microscope control using &#181;Manager software.</a> Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).</li><li>Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+behavioral+analysis,+microscopy,+and+neuronal+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).</li><li>NeuroTracker. GitHub Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/albrechtLab/Neurotracker">https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</a> (2022)</li><li>NeuroTracker User Guide. GitHub Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/albrechtLab/Neurotracker">https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</a> (2022)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Galotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+triggers+calcium-mediated+immune+response+in+the+plant+model+Physcomitrella+patens.">Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).</li><li>Qian, X., Song, H., Ming, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+organoids:+Advances,+applications+and+challenges.">Brain organoids: Advances, applications and challenges.</a> Development. 146 (8), 166074 (2019).</li><li>Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+synaptic+signaling,+regulation,+and+plasticity+distinguish+two+classes+of+C.+elegans+glutamatergic+neurons.">Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons.</a> eLife. 6, 31234 (2017).</li><li>Boulin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+fusions.">Reporter gene fusions.</a> WormBook. , (2006).</li></ol>

このプロトコルでは、さまざまな刺激パターンの時間的に正確な配信を使用して神経活動現象を評価するためのオープンアクセス顕微鏡システムについて説明します。マイクロ流体プラットフォームは、数十匹の動物を顕微鏡の視野に保ちながら、再現性のある刺激を提供します。さまざまな刺激タイミングパターンを簡単にプログラミングできる市販の顕微鏡ソフトウェアパッケージはほ?...

カルシウムイメージング技術は、蛍光顕微鏡および標的細胞で発現される遺伝的にコードされたカルシウム指示薬を使用して、in vivo神経ダイナミクスの非侵襲的記録を可能にしました1,2,3。これらのセンサーは通常、GFP-カルモジュリン-M13ペプチド(GCaMP)ファミリーなどの緑色蛍光タンパク質(GFP)を使用して、ニューロンの活性化と細胞内カルシウムレベルの上昇時に蛍光強度を増加させます。カルシウムイメージングは、線虫C.エレガンスにおいて、ニューロンおよび神経回路が生きた行動動物4,5,6,7,8,9,10においてどのように機能するかを調べるために特に強力であり、その透明な性質は光学的アクセスのための外科的プロセスが不要であり、細胞特異的遺伝子プロモーターは目的の細胞への発現を標的とする。これらの技術は、多くの場合、マイクロ流体デバイスを利用し、正確に制御された環境を提供して、生物学的、化学的、および物理的現象を小さな物理的スケールで研究します11,12。神経活動を測定するためのマイクロ流体デバイスは豊富にあり、新しいデザインが継続的に開発されており、研究室で容易に製造できます。ただし、多くの設計では一度に1匹の動物をトラップするため、実験スループットが制限されます7、9、13。神経反応は、以前の経験、ストレスや空腹などの内部状態、または遺伝子発現レベルなどの確率的要因の違いにより、動物によって大きく異なることがよくあります。これらの違いは、多くの動物を同時に刺激して観察し、個体から情報を抽出することができる方法の必要性を確立します4。
さらに、特定の神経調節現象は、刺激が急速に連続して発生したときの応答の短時間の抑制を指す時間的抑制14などの特定の刺激条件下でのみ明らかになる。電気生理学的システムは、この目的のために、例えば、電気パルス電流、電圧、周波数、波形、デューティサイクル、および周期的な刺激列のタイミングを変調して、広い刺激空間にわたって神経活動を駆動することができる。自然に検出された刺激または光遺伝学的システムによる間接刺激は、同様の幅の制御メカニズムの恩恵を受けるでしょう。現在、多くの自然な刺激は、柔軟性を追加するのが遅い商用システムを使用して、匂いの提示や除去などの単純な「オンオフ」の方法で提示されます。しかし、安価なマイクロコントローラは、研究者のニーズに合わせてカスタマイズ可能な方法で、いくつかのタイプの刺激の送達を自動化できるようになりました。マイクロフルイディクスと組み合わせることで、これらのシステムは実験スループットと柔軟性の向上という目標を達成し、さまざまな正確な刺激に対する神経応答を多くの動物で同時に測定できるようになりました4,6。マルチモーダル刺激は、薬物曝露などの直交摂動の前、最中、および後に一貫して刺激するときの神経興奮性の変化を監視することなどによって、ニューロン回路をさらに調べるために使用することができる4。安価でオープンな顕微鏡システムの利点は、科学研究を進める上で明らかですが、実際には、部品の調達、構築、および性能検証の必要性がこれらの技術の採用を妨げる可能性があります。
このプロトコルは、これらの技術的課題のいくつかを軽減することを目的としています。以前のプロトコルはマイクロ流体デバイスの使用と基本的な刺激に焦点を当てていました9、15、17、ここでは、前述のマイクロ流体デバイスを利用するC.エレガンスまたは他の小さな生物における神経イメージングのための柔軟で自動化されたマルチモーダル刺激送達システムの構築と使用について説明します4。オープンソースシステムは、実験を定義するために単純なテキストファイルを介してプログラムされ、NeuroTrackerデータ分析プログラムは、顕微鏡ビデオから神経活動データを半自動的に抽出します。光遺伝学的光感受性イオンチャネル5,6を発現する際に、異なる食品の匂いに応答して、または光に応答して脱分極する化学感覚ニューロンAWAを使用して、時間的抑制、脱抑制、および刺激クロストークを評価する例を使用して、このシステムを実証します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.&#160;coli (OP50)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>Cat# OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental models: Organisms/strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.&#160;elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work</td>
			<td>NZ1091, for example</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B85307</td>
			<td>diacetyl, example chemical stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein, Sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass water repellant</td>
			<td>Rain-X</td>
			<td>Cat #800002250</td>
			<td>glass hydrophobic treatment (single-use)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium (NGM) agar</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>Cat #: 20-273NGM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60&#160;mm)</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>Cat #T3305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184</td>
			<td>Dow Chemical</td>
			<td>Cat# 1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS)</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>CAS# 78560-45-9</td>
			<td>glass hydrophobic treatment (durable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino IDE</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>https://www.arduino.cc/en/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Albrecht Lab</td>
			<td>https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotracker data analysis software</td>
			<td>Albrecht Lab</td>
			<td>https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Microscope and Stimulation System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5&#215; objective or similar)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Cat #491237-0012-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>Cat #XYLIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Cat #C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino nano</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>Cat #A000005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12)</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Cat #LQX12-3W24FF48-000</td>
			<td>Valve 1: Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-way normally-closed (NC) Pinch Valve</td>
			<td>Bio-Chem Valve Inc</td>
			<td>Cat #075P2-S432</td>
			<td>Valve 2: Outflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way Pinch Valve</td>
			<td>NResearch</td>
			<td>Cat #161P091</td>
			<td>Valve 3: Stimulus selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm)</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveLink 8.2 digital/manual valve controller</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>Cat #01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wires and connectors</td>
			<td>various</td>
			<td>See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Device Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel variable speed rotary cutter 4000&#160;</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #F0134000AB</td>
			<td>Set speed to 5k RPM for cutting glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel drill press rotary tool workstation</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #220-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond drill bit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #7134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide, 1&#160;mm thick</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat #75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scribe (Diamond scriber)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>Cat #54468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer 3-way stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Cat #EW-30600-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer 23 G blunt needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat #89134-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device</td>
			<td>Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device clamp</td>
			<td>Warner Instruments (or machine shop)</td>
			<td>P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic tubing, 0.02&#8243; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Cat #EW-06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 19 G, 0.5&#8243;</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>Cat #NE-1027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated multimodal stimulation and simultaneous neuronal recording from multiple small organisms

蛍光遺伝暗号カルシウム指標は、個々の神経細胞レベルから脳回路全体までの神経動態の理解に大きく貢献しています。しかし、神経反応は、以前の経験、内部状態、または確率的要因によって異なる可能性があるため、一度に多くの個人の神経機能を評価できる方法が必要になります。ほとんどの記録技術は一度に1匹の動物を調べますが、広視野顕微鏡を使用して、ニューロンの記録を数十の カエノラブディティスエレガンス または他のサブミリメートルスケールの生物に一度にスケールアップすることについて説明します。オープンソースのハードウェアとソフトウェアにより、化学的、光学的、機械的、熱的、電磁的刺激など、さまざまな刺激タイプの強度とタイミングを制御する完全に自動化された実験をプログラミングする柔軟性が大幅に向上します。特に、マイクロ流体フローデバイスは、秒未満の時間分解能で化学感覚刺激の正確で再現性のある定量的制御を提供します。次に、NeuroTrackerの半自動データ分析パイプラインは、個人および集団全体の神経反応を抽出して、神経の興奮性とダイナミクスの機能的変化を明らかにします。本論文では、神経細胞の適応、時間的抑制、刺激クロストークの測定例を紹介します。これらの技術は、刺激の精度と再現性を高め、集団の多様性の探索を可能にし、細胞やオルガノイドから生物や植物全体に至るまで、小さな生物系における他の動的蛍光シグナルに一般化できます。

時間的抑制、適応、脱抑制など、さまざまな神経現象を評価する刺激パターンの例をいくつか紹介します。 時間的抑制 は、最初の提示の直後に起こる第2の刺激呈示に対する神経応答の瞬間的な抑制である14。この現象をテストするために、ペアパルス実験では、0秒から20秒の範囲の間隔で分離された2つの1秒の匂いパルスからなる8つのパターンが提示されまし...

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Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms

我々は、多くの カエノラブディティス・エレガンス 線虫からの同時神経活動の柔軟な化学的およびマルチモーダル刺激および記録のための方法を提示する。この方法は、マイクロフルイディクス、オープンソースのハードウェアとソフトウェア、および教師ありの自動データ分析を使用して、適応、時間的抑制、刺激クロストークなどの神経現象の測定を可能にします。

複数の小生物からの自動マルチモーダル刺激と同時神経記録

Fluorescent genetically encoded calcium indicators have contributed greatly to our understanding of neural dynamics from the level of individual neurons ...

神経反応は脳活動への洞察を与えますが、実験や個人によって異なる可能性があります。このプロトコルは、刺激の記録と分析を自動化し、さまざまなタイプとパターンの刺激のプログラミングを簡素化するのに役立ちます。自動化された技術により、複数のニューロンと生物を同じマイクロ流体フォーマットで並行して記録することができます。これにより、記録の再現性が向上し、集団間のニューロンの多様性を調査できるようになります。適応や感覚統合などの神経現象を明らかにするには、さまざまな刺激パターンが必要です。この方法は、細胞やオルガノイドから生物や植物への他の動的シグナルに一般化できます。まず、顕微鏡の電源を入れ、プライミングシリンジを使用してリザーバーチューブから気泡を充填および除去し、次に流出チューブにバッファーを充填します。マイクロ流体デバイスを真空デシケーターから取り外します。デバイスを顕微鏡に置き、出口チューブをすばやく挿入します。出口シリンジをそっと押して、液滴が入口から出てくるまでデバイスに液体を注入します。この液滴が出現した入口で、ドロップツードロップ接続を使用して対応する流体入口チューブを挿入し、気泡の導入を避けるために入口チューブとデバイス舷窓の両方に液滴が存在することを確認します。次のインレットチューブを次の液滴に接続します。必要に応じて出口からさらに液体を注入し、すべての入口が満たされるまで繰り返します。未使用のインレットとウォームローディングポートに固体ブロッキングピンを挿入します。画面上のフローをチェックして、フローが目的の方向に進むことを確認します。バルブコントローラーのバルブ1をフリップし、マイクロ流体アリーナに流れ込む刺激流を観察します。流量のバランスが崩れている場合は、リザーバーの高さを調整します。ワイヤーチップピックを使用して、播種されていない線虫増殖培地またはNGM寒天プレートに若年成体動物を移し、動物が泳ぐことができるように、プレートに約5ミリリットルの1つのXS基礎バッファーを浸します。1つのXS基礎バッファーが事前に充填された付属のチューブを使用して、ワームを1〜3ミリリットルのローディングシリンジに引き込みます。ステレオスコープを使用して、片手で液面下のチューブを目的の動物に移動し、もう一方の手に保持されたシリンジを使用してチューブに引き込みます。出口の輪郭を閉じ、ワームローディングピンを取り外し、ドロップツードロップ接続を使用してウォームローディングシリンジをデバイスに接続します。次に、動物をアリーナにそっと流します。バッファーフローを確立し、テトラミソールによる固定化に最大1時間待ちます。テキストエディタを使用して、ユーザー定義取得設定という名前の刺激定義テキストファイルを作成します。自動画像取得のための刺激設定を含むtxt。このファイルは、露光と励起のタイミング、試行期間、間隔、保存ディレクトリなどの顕微鏡取得パラメータを定義します。また、実験タイプと刺激タイミングの設定も定義します。1回の刺激実験では、刺激コマンドを1回だけ繰り返すフォーマットを使用します。マルチパターン実験では、刺激パターンの順序を表す数字のパターンシーケンスを含めることにより、複数の刺激コマンドを含む形式を使用します。パターンごとに、刺激コマンドを別々の行に入力します。次に、顕微鏡制御ソフトウェアを実行します。すべての流体入口が開いていること、アリーナ内で流れが望まれていること、および目的のニューロンがライブウィンドウ内で焦点を合わせていることを確認します。次に、ライブウィンドウを閉じて、スクリプトを実行します マルチパターン実行スクリプト。ソフトウェア内のbsh。データを分析するには、プラグインを順番にクリックし、次に追跡し、次にニューロトラッカーを実行して、ニューロトラッカーを実行します。追跡するtiffビデオファイルを含むフォルダーを選択し、処理するファイルの範囲を選択します。次に、画像メニューと調整メニューを使用して、明るさのコントラストとしきい値の制御ウィンドウを開きます。暗い背景を確認し、しきい値ウィンドウで範囲をリセットせず、しきい値の方法をデフォルトに設定し、視覚化を赤に設定します。次に、明るさのコントラストウィンドウで[自動]をクリックして、ニューロンを可視化します。明るさのコントラスト ウィンドウで、ニューロンが明確に区別できるまで、最小スライダーと最大スライダーを調整します。次に、すべてのニューロンが他のオブジェクトから分離された小さな赤い斑点として表示されるまで、しきい値レベルを調整します。フレームスライダーを調整してニューロンの動きと強度の変化を観察し、他の動物との重複など、追跡から除外する動物に注意を払います。追跡するニューロンを特定した後、必要に応じて各動物の閾値レベルを調整し、ニューロンの上の赤い閾値領域がすべてのフレームに表示されるようにします。ニューロンをクリックして、その位置としきい値レベルを記録します。すべてのニューロンを選択したら、スペースバーを押して追跡を開始します。各動物の追跡プロセスを監視し、必要な修正を行います。ニューロトラッカーが一時停止すると、ニューロンが失われます。必要に応じてしきい値レベルを調整し、ニューロンを再度クリックします。統合ボックスが近くの別の動物または非ニューロン構造にジャンプする場合は、スペースバーを押して一時停止します。スライダーを最初の誤ったフレームに戻し、正しいニューロンの位置を再度クリックします。ニューロトラッカーを実行します概要pdf。mファイルをMATLABに保存し、ニューロトラッカーデータテキストファイルを含むフォルダを選択します。サマリー PDF が生成されるのを待ち、追跡プロセスの検証が可能になります。動物は、各動物および試験からの番号および神経反応によって識別することができ、集団変動性を評価するために観察することができる。関数データブラウズを使用します。mは、試行番号、動物番号、刺激パターン、または別のカテゴリによってグループ化されたニューラルデータを探索する。時間的抑制現象は、0秒から20秒の範囲の間隔で分離された2つの1秒の匂い物質パルスからなる8つのパターンを生成するペアパルス実験でテストされました。最初の1秒間の匂いパルスは、ジアセチル検出AWAニューロンにおいて等しい応答の大きさを誘発し、第2パルスにおける応答は刺激間間隔によって変化した。ジアセチル刺激への適応が観察されたキャッチトライアル実験により脱抑制を評価したが、新規2-メチルピラジン刺激の提示は強い脱抑制効果を誘発しなかった。テストされたマルチモーダル刺激は、化学的刺激のみが適応を引き起こすのに対し、光刺激のみでは適応を引き起こさないことを明らかにした。しかし、組み合わせたマルチモーダル刺激パターンは、光原性応答が化学的に誘発された適応の影響を受けやすいことを示しました。マイクロ流体設計を変更して2つのアリーナを含めることで、遺伝的またはその他の摂動を、一致する参照と同時に比較できます。セットアップが完了すると、システムはさまざまな方法で変更できます。例えば、化学物質の線量反応や、睡眠状態と覚醒状態の間などの神経活動の状態依存的な変化を自動的に測定しました。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Design and Construction of a Cost Effective Headstage for Simultaneous Neural Stimulation and Recording in the Water Maze

水迷路における同時神経刺激および記録のためのコスト効率のヘッドステージの設計と構築

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial ...

神経科学

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

複数のスケールでデジタル化された神経形態の自動化されたショールの分析

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

マルチ認知機能のテストとげっ歯類の神経活動を記録するための完全に自動化された汎用性の高いシステム

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

からの同時プリとポストシナプスの電気生理学的記録<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;神経筋共培養

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

げっ歯類での同時のfMRIと脳深部刺激

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

行動するミツバチの二つの神経の処理段階での同時長期レコーディング

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

神経細胞の金ナノロッド補助光刺激

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats

麻酔ラットにおける電図および視覚誘発電位の同時記録

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the ...