Name: determination of self-(in)compatibility and inter-(in)compatibility relationships in citrus using manual pollination, microscopy, and s-genotype analyses
Uploaded: 2023-06-30T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses at JoVE.

Dette prosjektet ble støttet økonomisk av National Natural Science Foundation of China (32122075, 32072523).

1. Forberedelse for anilinblå farging
<ol><li>Forbered følgende reagenser og verktøy for forsøket: en pollinatorbørste, pinsett, blyant, sulfatpapir, en pollineringspose, zip lock-poser, binders, formaldehyd, iseddik, absolutt etanol, sentrifugerør, tang, limdroppere, glassglass, coverslips, skalpeller og polyetylenglykol.</li>
	<li>Tilbered in vitro spiringsmedium inneholdende 0,02% MgSO4, 0,01% KNO 3, 0,03% Ca (NO 3) 2, 0,01% H 3 BO 3</s...

<ol>
	<li>Matsumoto, D., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+S-RNases+by+an+S+locus+F-box+like+protein+and+an+S+haplotype-specific+F-box+like+protein+in+the+Prunus-specific+self-incompatibility+system.">Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system.</a> Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).</li><li>Goldberg, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+selection+maintains+self-incompatibility.">Species selection maintains self-incompatibility.</a> Science. 330 (6003), 493-495 (2010).</li><li>Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+on+fruit+quality+of+Guangfeng+Ma+jia+pummelo+and+Pinghe+red+pummelo.">Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo.</a> China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).</li><li>Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+on+self-incompatibility+mechanism+in+fruit+trees.">Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees.</a> Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).</li><li>Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-self-+and+self-recognition+models+in+plant+self-incompatibility.">Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility.</a> Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).</li><li>Meng, X., Sun, P., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-RNase-based+self-incompatibility+in+Petunia+inflata.">S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata.</a> Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).</li><li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+self-compatibility+by+a+mutant+Sm-RNase+in+citrus.">Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus.</a> Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).</li><li>Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-incompatibility+triggers+programmed+cell+death+in+Papaver+pollen.">Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen.</a> Nature. 429, 305-309 (2004).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulated+expression+of+S2-RNase+attenuates+self-incompatibility+in+&amp;#34;Guiyou+No.+1&amp;#34;+pummelo.">Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in &amp;#34;Guiyou No. 1&amp;#34; pummelo.</a> Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).</li><li>Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+selection+in+self-compatible+wild+tobacco+results+from+coordinated+variation+in+homologous+self-Incompatibility+genes.">Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes.</a> Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).</li><li>Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollen+S-locus+F-box+proteins+of+petunia+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility+are+themselves+subject+to+ubiquitin-mediated+degradation.">Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation.</a> The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).</li><li>Hua, Z., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+components+of+a+putative+petunia+S-locus+F-box-containing+E3+ligase+complex+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility.">Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility.</a> Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).</li><li>Entani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-proteasome-mediated+degradation+of+S-RNase+in+a+solanaceous+cross-compatibility+reaction.">Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction.</a> The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).</li><li>Abdallah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+self-incompatibility+and+genetic+diversity+in+diploid+and+hexaploid+plum+genotypes.">Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).</li><li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+production+in+the+new+generation+of+apricot+cultivars:+self-incompatibility,+S-RNase+allele+identification,+and+incompatibility+group+assignment.+.">Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. .</a> Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).</li><li>Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phalaenopsis+pollinia+storage+at+sub-zero+temperature+and+its+pollen+viability+assessment.">Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment.</a> Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).</li><li>Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+evolution+of+genes+related+to+self-incompatibility+in+citrus.">Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus.</a> , (2019).</li><li>Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+protocol+for+genomic+DNA+extraction+from+Citrus+species.">An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+S-genotypes+of+63+pummelo+germplasm+resources.">Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources.</a> Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).</li><li>de Nettancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompatibility+in+angiosperms.">Incompatibility in angiosperms.</a> Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).</li><li>Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+self-incompatibility+and+its+evolutionary+consequences.">Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences.</a> International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).</li><li>Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+pollination+requirements+in+Japanese+plum+by+phenological+monitoring,+hand+pollinations,+fluorescence+microscopy+and+molecular+genotyping.">Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).</li><li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+self-+and+inter-(in)compatibility+relationships+in+apricot+combining+hand-pollination,+microscopy+and+genetic+analyses.">Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).</li></ol>

I fruktavlinger er både parthenocarpy og SI viktige egenskaper fordi de baner vei for frøfrie frukter - en egenskap som er høyt verdsatt av forbrukerne. Selvinkompatibilitet fremmer avvisning av selvpollen og forhindrer dermed innavl20. Blant sitrus er pummelo en selvinkompatibel variasjon7. Nesten 40% av alle angiospermarter utviser SI21. Denne egenskapen forhindrer fruktinnstilling, senker utbyttet og gir store økonomiske tap for dyrkere. For ?...

Selvinkompatibilitet (SI) er en genetisk kontrollert mekanisme som er tilstede i omtrent 40% av angiospermarter. I denne prosessen avviser pistilen pollen fra en plante med samme SI-genotype og forhindrer dermed selvbefruktning 1,2. Ma jia pummelo er et lokalt utvalg i Jinagsu-provinsen, Kina, med de utmerkede egenskapene til stor, rosa frukt, et rikt juiceinnhold, en søt og sur smak og en tykk peeling3. Selv om SI fremmer utparring, påvirker det utbyttet og kvaliteten på frukt4 negativt og nødvendiggjør egnede polliniseringstrær med forskjellige SI-genotyper for pålitelige fruktsettingshastigheter og høye utbytter. For tiden er det to hovedtyper av SI, sporofytisk selvinkompatibilitet (SSI), representert av Brassicaceae, og gametofytisk selvinkompatibilitet (GSI), representert av Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae og Solanaceae 5,6,7,8.
Sitrus er en av de viktigste fruktavlinger i verden. Det S-RNase-baserte GSI-systemet finnes i mange sitrustilganger og påvirker fruktinnstillingshastigheten9 negativt. I dette systemet styres SI av S-lokuset, et enkelt polymorft locus med to komplekse alleler som bærer pistil S-determinanter og pollen S-determinanter 7. Den kvinnelige determinanten er S ribonuklease (S-RNase), og den mannlige determinanten er S locus F-box (SLF)7. Cellene i pistilen utskiller S-RNase-proteiner. De ikke-selv-S-RNasene gjenkjennes av SLF-proteinene, noe som fører til ubiquitinering og nedbrytning av ikke-selv-S-RNasene ved 26S-proteasomveien. I motsetning til dette er de selv-S-RNasene i stand til å akkumulere og hemme pollenrør (PT) vekst fordi de unngår SLF-proteinene og derfor forhindres fra ubiquitinzation10,11,12,13.
Her rapporterer vi en in vivo-teknikk som er nyttig for å identifisere S-genotyper og grader av pollenkompatibilitet og inkompatibilitet. Protokollen innebærer å trekke ut totalt DNA fra blader og forutsi S-genotypen ved hjelp av S-spesifikke primere. Videre gir anilinblå farging og fluorescensmikroskopi etterfulgt av håndpollinering bevis for graden av kompatibilitet og inkompatibilitet. Semi in vivo pollineringsprosedyren, som innebærer manuell pollinering av blomster i laboratoriet14,15, har også blitt tilpasset for å vurdere graden av selvkompatibilitet og inkompatibilitet. Imidlertid har vi også brukt feltpollinering etterfulgt av bagging av blomster for å unngå forurensning fra uønsket pollen for å la pollenrørene utvikle seg under naturlige forhold. Denne protokollen er enkel og grei og gir den informasjonen som er nødvendig for vellykket valg av egnede pollineringstrær.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, H3BO3</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10004818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown bottle</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>80029062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal tube</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB</td>
			<td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td>
			<td>57-09-0(CAS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropping</td>
			<td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10009617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automatic sample fast grinder</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td>
			<td>Tissuelyser-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glacial acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10000218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Tube</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10003218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>80109218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>label</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td>Shanghai Leica Co.,Ltd</td>
			<td>21903797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10013018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE Cover glass</td>
			<td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper clips</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pencil</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pollinator brush</td>
			<td>Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, PEG 6000</td>
			<td>Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>DH229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, PEG-4000</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd</td>
			<td>1521GR500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide, KOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10017008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate, KNO3</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10017218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, NAOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfate paper</td>
			<td>Taizhou Jinnong Mesh Factory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat water bath</td>
			<td>Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd</td>
			<td>L-909193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10006818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4</td>
			<td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>20032318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zip lock bags</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td>
			<td>60-24-2(CAS)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of self-(in)compatibility and inter-(in)compatibility relationships in citrus using manual pollination, microscopy, and s-genotype analyses

Sitrus bruker S-RNase-basert selvinkompatibilitet for å avvise selvpollen og krever derfor nærliggende polliniseringstrær for vellykket pollinering og befruktning. Imidlertid er det en tidkrevende prosess å identifisere egnede varianter som skal tjene som pollinisatorer. For å løse dette problemet har vi utviklet en rask metode for å identifisere pollineringskompatible sitruskultivarer som bruker agarosegelelektroforese og anilinblå farging. Pollenkompatibilitet bestemmes basert på identifisering av S-genotyper ved å ekstrahere totalt DNA og utføre PCR-baserte genotypingsanalyser med spesifikke primere. I tillegg samles stiler 3-4 dager etter manuell pollinering, og anilinblå farging utføres. Til slutt observeres vekststatusen til pollenrørene med et fluorescensmikroskop. Pollenkompatibilitet og inkompatibilitet kan etableres ved å observere om pollenrørets vekst er henholdsvis normal eller undertrykt. På grunn av sin enkelhet og kostnadseffektivitet er denne metoden et effektivt verktøy for å bestemme pollenkompatibiliteten og inkompatibiliteten til forskjellige sitrusvarianter for å etablere inkompatibilitetsgrupper og inkompatibilitetsforhold mellom forskjellige kultivarer. Denne metoden gir informasjon som er avgjørende for et vellykket utvalg av egnede pollineringstrær, og letter dermed etableringen av nye frukthager og valg av passende foreldre for avlsprogrammer.

For forsøkene som ble gjort her, ble modne blomster valgt, støtfangerne ble samlet, tørket i en ovn, og pollen ble spiret ved 28 ° C i 12 timer. Pollenets levedyktighet og spireevne ble kvantifisert som vist i figur 1.
Sitrus ble pollinert manuelt, og pollenkompatibilitet og uforlikelighet ble vurdert ved hjelp av anilinblå farging og fluorescensmikroskopi. Den kompatible pollen kan spire på overflaten av stigmaet og produsere et normalt pollenrør som kan v...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses at JoVE.

Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Denne protokollen gir en rask metode for å bestemme pollenkompatibilitet og inkompatibilitet i sitruskultivarer.

Bestemmelse av selv-(u)kompatibilitet og inter-(in)kompatibilitetsrelasjoner i sitrus ved hjelp av manuell pollinering, mikroskopi og S-genotypeanalyser

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

Denne teknikken kan effektivt identifisere S-genotypen og nøyaktig identifisere sitrus selvinkompatibilitet, og gir nødvendig informasjon for å velge egnede pollenizertrær. Dette er en tidseffektiv, enkel og pålitelig teknikk for å velge de riktige foreldretrærne i avlsprogrammer. Denne teknikken er enkel og lett å gjøre, og å eksperimentere for første gang trenger tålmodighet og omsorg.S-genotypeidentifikasjon og S-spesifikk primerdesign trenger mer oppmerksomhet og omsorg. Demonstrere prosedyren vil være Yu Hu, en mastergradsstudent fra laboratoriet mitt. Begynn polleninnsamling ved å ta Majia pomelo, Citrus maxima, blomster til laboratoriet.Samle støtfangerne ved hjelp av pinsett og legg dem i en petriskål som inneholder filterpapir. Tørk pollenkornene ved å plassere petriskålen som inneholder støtfangerne i en ovn på 28 grader i 24 timer. Etter tørking, lagre pollen i en Micro Centron lufttett zip lock pose som inneholder fargeskiftende silikagel.Lukk posen og merk posen med navnet på pollensorten og datoen for lagring. Hell 300 mikroliter av væskemediet i hetten på et to-milliliter sentrifugerør og dryss pollen jevnt ved hjelp av en pollineringsbørste. Plasser pollen i en fuktet svart boks og rug ved 28 grader Celsius i 12 timer.Etter inkubering, kutt den øverste en millimeter spissen av en 1.000 mikroliter pipettespiss og aspirer pollen med en liten mengde kulturløsning. Plasser pollen i midten av mikroskoplysbildet og dekk det med et deksel. Når du er ferdig, observer prøven med et omvendt mikroskop ved hjelp av et 10X-objektiv.Utfør tre uavhengige replikater med omtrent samme pollentetthet for hver replikasjon. For pollinering, bruk en pollineringsbørste for å spre tilstrekkelig mengde levedyktig pollen på overflaten av stigmaet, og sørg for ikke å skade pistilen. Dekk de pollinerte blomstene med en sulfatpapirpose og forhindre pollinering ved genotypisk forskjellige pollen ved å forsegle posen ved hjelp av en binders.Skriv navnet på arten og antall og tidspunkt for pollinering på etiketten. Heng etiketten på grenene i nærheten av de pollinerte blomstene. Fjern pollineringsposene omtrent tre til fire dager etter pollinering og samle de pollinerte blomstene i zip lock-poser.Fjern straks kronbladene, beholderne og eggstokkene fra blomstene og senk stigmaet smeltet til stil i et sentrifugerør som inneholder en nytilberedt fiksativ løsning. Inkuber stigmaet og stilen i fikseringsløsningen over natten ved fire grader Celsius. Neste dag, kast den fikserende løsningen før du vasker stigmaet og stilen to til tre ganger i 95% etanol.Deretter tilsettes 70% etanoloppløsning til stilen, slik at prøven er helt nedsenket i løsningen. Stilene på dette stadiet kan lagres ved fire grader Celsius i en til to måneder. For anilinblå farging, vask stilprøvene lagret i 70% etanol med destillert vann tre til fire ganger.Dypp den i en fire molar natriumhydroksidløsning og forsegle den før du inkuberer den i et 65 grader Celsius vannbad i 60 minutter. I løpet av dette trinnet endres fargen på stilen fra gulhvit til oransje-rød. Deretter suge stilene i destillert vann.Etter 30 minutter, kast destillert vann og vask stilene med destillert vann tre til fire ganger eller til fargen på stilen blir gul. Deretter legger du til anilinblått til prøven er nedsenket og ruger i 12 timer i mørket. Observer pollenrørets vekst under fluorescensmikroskopet.Plasser lysbildet på et flatt bord. Del stilen i to halvdeler langs lengdeaksen ved hjelp av en skalpell. Plasser halvparten av stilen på et lysbilde og tilsett to til tre dråper polyetylenglykol til overflaten av lysbildet.Dekk den deretter til med en deksellapp. Når du er ferdig, plasser lysbildet på mikroskoptrinnet over blenderåpningen og visualiser ved hjelp av et 10X-mål. Bruk DAPI-filteret og observer pollenrørveksten.Observer fem stiler for hver type pollinering. Pollen levedyktighet av Citrus maxima og spiring hastigheter ble kvantifisert ved hjelp av fluorescerende mikroskopi. Den kompatible pollen spiret vellykket på overflaten av stigmaet og produserte et normalt pollenrør, som vokste og til slutt førte til befruktning i eggstokken.I kontrast vokste inkompatible pollenrør gjennom omtrent 2/3 av stilen og sluttet deretter å vokse. Agarosegelelektroforese oppdaget DNA-produktet amplifisert ved hjelp av S-lokusspesifikke primere. Det viste amplifiseringen av DNA-produktet mellom 500 og 1.000 basepar.Den tilsvarende S-genotypen ble identifisert. 21 S haplotyper i forskjellige sitrusarter ble identifisert ved hjelp av denne metoden. Pollineringstrinnet er kritisk.Bare vellykket pollinering kan sikre etterfølgende observasjon av pollenrør. Teknikken ble brukt til å analysere selvinkompatibilitetstrekkene og å utforske og identifisere de kvinnelige determinanter av selvinkompatibiliteten. Denne metoden er viktig for selvinkompatibilitetsforskning og avlsprogrammer.Det kan også legge til rette for at bondesamfunnet kan velge polleniseringstrær til frukthagene sine.

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats

Manuell Restraint og Common Compound Administrasjon Ruter i mus og rotter

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research.  Working confidently and humanely with mice and ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Protein Lokalisering Bruke Photo-aktivert Lokalisering Mikroskopi og elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Ved hjelp av høyoppløselig CT for å visualisere tredimensjonale struktur og funksjon Plant vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Analysere Kraniofacial Morphogenesis i sebrafisk ved hjelp av 4D konfokalmikroskopi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonal Sporing av Hematopoetiske Stem og stamceller Preget av fem Fluorescent Proteiner bruker Confocal og multiphoton Mikros

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Bestemmelse av fettsyreoksidasjon og lipogenese i Mouse primære hepatocytter

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Måle Stivhet<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mus Aorta Bruke Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Felt-deployerbar Candidatus Liberibacter asiaticus deteksjon ved bruk av rekombinase polymeraseforsterkning kombinert med CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...