Name: determination of self-(in)compatibility and inter-(in)compatibility relationships in citrus using manual pollination, microscopy, and s-genotype analyses
Uploaded: 2023-06-30T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses at JoVE.

Este projeto foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32122075, 32072523).

1. Preparação para coloração de azul de anilina
<ol><li>Prepare os seguintes reagentes e ferramentas para o experimento: escova polinizadora, pinça, lápis, papel sulfato, saco de polinização, sacos zip lock, clipes de papel, formaldeído, ácido acético glacial, etanol absoluto, tubos de centrífuga, pinças, conta-gotas de cola, lâminas de vidro, lamínulas, bisturis e polietilenoglicol.</li>
	<li>Preparar meio de germinação in vitro contendo 0,02% de MgSO4, 0,01% de KN...

<ol>
	<li>Matsumoto, D., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+S-RNases+by+an+S+locus+F-box+like+protein+and+an+S+haplotype-specific+F-box+like+protein+in+the+Prunus-specific+self-incompatibility+system.">Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system.</a> Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).</li><li>Goldberg, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+selection+maintains+self-incompatibility.">Species selection maintains self-incompatibility.</a> Science. 330 (6003), 493-495 (2010).</li><li>Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+on+fruit+quality+of+Guangfeng+Ma+jia+pummelo+and+Pinghe+red+pummelo.">Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo.</a> China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).</li><li>Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+on+self-incompatibility+mechanism+in+fruit+trees.">Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees.</a> Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).</li><li>Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-self-+and+self-recognition+models+in+plant+self-incompatibility.">Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility.</a> Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).</li><li>Meng, X., Sun, P., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-RNase-based+self-incompatibility+in+Petunia+inflata.">S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata.</a> Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).</li><li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+self-compatibility+by+a+mutant+Sm-RNase+in+citrus.">Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus.</a> Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).</li><li>Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-incompatibility+triggers+programmed+cell+death+in+Papaver+pollen.">Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen.</a> Nature. 429, 305-309 (2004).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulated+expression+of+S2-RNase+attenuates+self-incompatibility+in+&amp;#34;Guiyou+No.+1&amp;#34;+pummelo.">Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in &amp;#34;Guiyou No. 1&amp;#34; pummelo.</a> Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).</li><li>Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+selection+in+self-compatible+wild+tobacco+results+from+coordinated+variation+in+homologous+self-Incompatibility+genes.">Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes.</a> Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).</li><li>Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollen+S-locus+F-box+proteins+of+petunia+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility+are+themselves+subject+to+ubiquitin-mediated+degradation.">Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation.</a> The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).</li><li>Hua, Z., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+components+of+a+putative+petunia+S-locus+F-box-containing+E3+ligase+complex+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility.">Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility.</a> Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).</li><li>Entani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-proteasome-mediated+degradation+of+S-RNase+in+a+solanaceous+cross-compatibility+reaction.">Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction.</a> The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).</li><li>Abdallah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+self-incompatibility+and+genetic+diversity+in+diploid+and+hexaploid+plum+genotypes.">Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).</li><li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+production+in+the+new+generation+of+apricot+cultivars:+self-incompatibility,+S-RNase+allele+identification,+and+incompatibility+group+assignment.+.">Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. .</a> Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).</li><li>Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phalaenopsis+pollinia+storage+at+sub-zero+temperature+and+its+pollen+viability+assessment.">Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment.</a> Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).</li><li>Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+evolution+of+genes+related+to+self-incompatibility+in+citrus.">Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus.</a> , (2019).</li><li>Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+protocol+for+genomic+DNA+extraction+from+Citrus+species.">An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+S-genotypes+of+63+pummelo+germplasm+resources.">Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources.</a> Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).</li><li>de Nettancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompatibility+in+angiosperms.">Incompatibility in angiosperms.</a> Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).</li><li>Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+self-incompatibility+and+its+evolutionary+consequences.">Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences.</a> International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).</li><li>Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+pollination+requirements+in+Japanese+plum+by+phenological+monitoring,+hand+pollinations,+fluorescence+microscopy+and+molecular+genotyping.">Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).</li><li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+self-+and+inter-(in)compatibility+relationships+in+apricot+combining+hand-pollination,+microscopy+and+genetic+analyses.">Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).</li></ol>

Em fruticulturas, tanto a partenocarpia quanto o SI são características importantes, pois abrem caminho para frutos sem sementes - uma característica muito apreciada pelos consumidores. A autoincompatibilidade promove a rejeição do autopólen e, assim, previne a endogamia20. Entre os citros, o pummelo é uma variedade auto-incompatível7. Quase 40% de todas as espécies de angiospermas apresentam SI21. Essa característica impede a frutificaçã...

A autoincompatibilidade (IE) é um mecanismo geneticamente controlado presente em aproximadamente 40% das espécies de angiospermas. Nesse processo, o pistilo rejeita o pólen de uma planta com o mesmo genótipo SI e, assim, impede a autofecundação 1,2. Ma jia pummelo é uma variedade local na província de Jinagsu, China, com as excelentes qualidades de frutas grandes e cor-de-rosa, um rico teor de suco, um sabor doce e azedo e uma casca grossa3. Embora o SI promova o cruzamento, ele impacta negativamente a produtividade e a qualidade dos frutos4 e necessita de árvores polinizadoras adequadas com genótipos distintos de SI para taxas de frutificação confiáveis e altas produtividades. Atualmente, existem dois tipos principais de SI, a autoincompatibilidade esporofítica (ISC), representada por Brassicaceae, e a autoincompatibilidade gametofítica (IGS), representada por Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae e Solanaceae 5,6,7,8.
A citricultura é uma das culturas frutíferas mais importantes do mundo. O sistema GSI à base de S-RNase é encontrado em muitos acessos de citros e influencia negativamente a taxa de frutificação9. Nesse sistema, o SI é controlado pelo locus S, um único locus polimórfico com dois alelos complexos que carregam determinantes do pistilo S e determinantes do pólen S 7. O determinante feminino é a ribonuclease S (S-RNase), e o masculino é o locus S F-box (SLF)7. As células do pistilo secretam proteínas S-RNase. As RNAs-S não-auto são reconhecidas pelas proteínas SLF, o que leva à ubiquitinação e degradação das S-RNases não-auto pela via do proteassoma 26S. Em contrapartida, as auto-S-RNases são capazes de acumular e inibir o crescimento do tubo polínico (TP), pois escapam das proteínas SLF e, portanto, são impedidas de ubiquitinzação10,11,12,13.
Aqui, relatamos uma técnica in vivo que é útil para identificar genótipos S e graus de compatibilidade e incompatibilidade polínica. O protocolo envolve a extração de DNA total das folhas e a predição do genótipo S por meio de primers S-específicos. Além disso, a coloração com azul de anilina e a microscopia de fluorescência seguida de polinização manual fornecem evidências do grau de compatibilidade e incompatibilidade. O procedimento de polinização semi in vivo, que envolve a polinização manual das flores em laboratório14,15, também foi adaptado para avaliar os graus de autocompatibilidade e incompatibilidade. No entanto, também utilizamos a polinização a campo seguida do ensacamento das flores para evitar a contaminação por pólen indesejado para permitir que os tubos polínicos se desenvolvam em condições naturais. Este protocolo é simples e direto e fornece as informações necessárias para a seleção bem-sucedida de árvores polinizadoras adequadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, H3BO3</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10004818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown bottle</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>80029062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal tube</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB</td>
			<td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td>
			<td>57-09-0(CAS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropping</td>
			<td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10009617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automatic sample fast grinder</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td>
			<td>Tissuelyser-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glacial acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10000218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Tube</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10003218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>80109218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>label</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td>Shanghai Leica Co.,Ltd</td>
			<td>21903797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10013018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE Cover glass</td>
			<td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper clips</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pencil</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pollinator brush</td>
			<td>Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, PEG 6000</td>
			<td>Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>DH229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, PEG-4000</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd</td>
			<td>1521GR500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide, KOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10017008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate, KNO3</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10017218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, NAOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfate paper</td>
			<td>Taizhou Jinnong Mesh Factory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat water bath</td>
			<td>Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd</td>
			<td>L-909193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10006818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4</td>
			<td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>20032318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zip lock bags</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td>
			<td>60-24-2(CAS)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of self-(in)compatibility and inter-(in)compatibility relationships in citrus using manual pollination, microscopy, and s-genotype analyses

Os citros usam a autoincompatibilidade baseada em S-RNase para rejeitar o autopólen e, portanto, requer árvores polinizadoras próximas para o sucesso da polinização e fertilização. No entanto, identificar variedades adequadas para servir como polinizadores é um processo demorado. Para resolver este problema, desenvolvemos um método rápido para identificar cultivares de citros compatíveis com polinização que utiliza eletroforese em gel de agarose e coloração com azul de anilina. A compatibilidade polínica é determinada com base na identificação de genótipos S por meio da extração de DNA total e da realização de ensaios de genotipagem baseados em PCR com primers específicos. Além disso, os estilos são coletados 3-4 dias após a polinização manual, e a coloração com azul de anilina é realizada. Finalmente, o estado de crescimento dos tubos polínicos é observado com um microscópio de fluorescência. A compatibilidade e a incompatibilidade polínica podem ser estabelecidas observando-se se o crescimento do tubo polínico é normal ou suprimido, respectivamente. Devido à sua simplicidade e custo-efetividade, este método é uma ferramenta eficaz para determinar a compatibilidade e incompatibilidade polínica de diferentes variedades de citros para estabelecer grupos de incompatibilidade e relações de incompatibilidade entre diferentes cultivares. Este método fornece informações essenciais para o sucesso da seleção de polinizadores adequados e, assim, facilita o estabelecimento de novos pomares e a seleção de genitores apropriados para programas de melhoramento.

Para os experimentos realizados foram selecionadas flores maduras, coletadas as anteras, secas em estufa e o pólen germinado a 28°C por 12 h. A viabilidade polínica e as taxas de germinação foram quantificadas como mostra a Figura 1.
Os citros foram polinizados manualmente, e a compatibilidade e incompatibilidade polínica foram avaliadas pela coloração com azul de anilina e microscopia de fluorescência. O pólen compatível poderia germinar na superfície...

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Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Este protocolo fornece um método rápido para determinar a compatibilidade e incompatibilidade polínica em cultivares de citros.

Determinação das relações de auto-(in)compatibilidade e (in)compatibilidade em citros utilizando polinização manual, microscopia e análises de genótipo S

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

Esta técnica pode identificar eficientemente o genótipo S e identificar com precisão a autoincompatibilidade dos citros, fornecendo informações necessárias para a seleção de árvores polinizadoras adequadas. Esta é uma técnica eficiente em termos de tempo, simples e confiável para selecionar as árvores matrizes apropriadas em programas de melhoramento. Esta técnica é simples e fácil de fazer e fazer experimento pela primeira vez requer paciência e cuidado.A identificação do genótipo S e o desenho do primer específico S necessitam de maior atenção e cuidado. Quem demonstrará o procedimento será Yu Hu, mestrando do meu laboratório. Comece a coleta de pólen levando as flores de Majia pomelo, Citrus maxima, para o laboratório.Recolher as anteras com uma pinça e colocá-las numa placa de Petri contendo papel de filtro. Secar os grãos de pólen colocando a placa de Petri contendo as anteras em forno de 28 graus Celsius por 24 horas. Após a secagem, guarde o pólen em um saco zip lock hermético Micro Centron contendo sílica gel que muda de cor.Feche o saco e rotule-o com o nome da variedade de pólen e a data de armazenamento. Despeje 300 microlitros do meio líquido na tampa de um tubo de centrífuga de dois mililitros e polvilhe o pólen uniformemente com a ajuda de uma escova de polinização. Coloque o pólen em uma caixa preta umidificada e incube a 28 graus Celsius por 12 horas.Após a incubação, corte a ponta superior de um milímetro de uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros e aspirar o pólen com uma pequena quantidade de solução de cultura. Coloque o pólen no centro da lâmina do microscópio e cubra-o com uma lamínula. Uma vez feito, observar o espécime com um microscópio invertido usando uma objetiva de 10X.Execute três réplicas independentes usando aproximadamente a mesma densidade de pólen para cada réplica. Para a polinização, use uma escova de polinização para espalhar uma quantidade suficiente de pólen viável na superfície do estigma, garantindo que não danifique o pistilo. Cubra as flores polinizadas com um saco de papel sulfato e evite a polinização por pólenes genotipicamente distintos, selando o saco com um clipe de papel.Escreva o nome da espécie e o número e o tempo de polinização no rótulo. Pendure o rótulo nos galhos próximos às flores polinizadas. Retirar os sacos de polinização aproximadamente três a quatro dias após a polinização e coletar as flores polinizadas em sacos zip lock.Remova imediatamente as pétalas, recipientes e ovários das flores e mergulhe o estigma fundido em um tubo de centrífuga contendo uma solução fixadora recém-preparada. Incube o estigma e o estilo na solução fixadora durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, descarte a solução fixadora antes de lavar o estigma e modelar de duas a três vezes em etanol 95%.Em seguida, adicione a solução de etanol a 70% ao estilo, garantindo que a amostra esteja completamente imersa na solução. Os estilos nesta fase podem ser armazenados a quatro graus Celsius por um a dois meses. Para coloração de azul de anilina, lavar as amostras de estilo armazenadas em etanol 70% com água destilada de três a quatro vezes.Mergulhe-o em uma solução de hidróxido de sódio de quatro molares e sele antes de incubá-lo em banho-maria de 65 graus Celsius por 60 minutos. Durante esta etapa, a cor do estilo muda de amarelo-branco para laranja-vermelho. Em seguida, mergulhe os estilos em água destilada.Após 30 minutos, descarte a água destilada e lave os estilos com água destilada de três a quatro vezes ou até que a cor do estilo fique amarela. Em seguida, adicione o azul de anilina até que a amostra esteja submersa e incube por 12 horas no escuro. Observar o crescimento do tubo polínico ao microscópio de fluorescência.Coloque o slide em uma mesa plana. Divida o estilo em duas metades ao longo do eixo longitudinal usando um bisturi. Coloque metade do estilo em uma lâmina de vidro e adicione duas a três gotas de polietilenoglicol à superfície da lâmina.Em seguida, cubra com uma tampa. Uma vez feito, coloque a lâmina no estágio do microscópio acima da abertura e visualize usando uma objetiva de 10X. Use o filtro DAPI e observe o crescimento do tubo polínico.Observe cinco estilos para cada tipo de polinização. A viabilidade polínica de Citrus maxima e as taxas de germinação foram quantificadas por microscopia fluorescente. O pólen compatível germinou com sucesso na superfície do estigma e produziu um tubo polínico normal, que cresceu e, finalmente, levou à fecundação no ovário.Em contraste, tubos polínicos incompatíveis cresceram através de aproximadamente 2/3 do estilo e depois pararam de crescer. A eletroforese em gel de agarose detectou o produto DNA amplificado usando os primers locus-specific S. Mostrou a amplificação do produto do DNA entre 500 a 1.000 pares de bases.O genótipo S correspondente foi identificado. 21 haplótipos S em diferentes espécies de citros foram identificados por esse método. A etapa de polinização é fundamental.Somente a polinização bem sucedida pode garantir a observação subsequente dos tubos polínicos. A técnica foi utilizada para analisar os traços de autoincompatibilidade e explorar e identificar os determinantes femininos da autoincompatibilidade. Este método é importante para pesquisas de autoincompatibilidade e programas de melhoramento.Também pode facilitar a comunidade agrícola para a seleção de árvores polinizadoras para seus pomares.

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Biologia

Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats

Restrição manual e rotas de Administração composto comum em camundongos e ratos

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research.  Working confidently and humanely with mice and ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Evisceração de Vítreo Mouse e Retina de Análises Proteômica

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-Fem: localização de proteínas usando a foto-ativada Microscopia Localização e Microscopia Eletrônica

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Usando tomografia de tórax para visualizar a estrutura tridimensional e Função da Usina Vasculatura

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Determinação da oxidação de ácidos gordos e Lipogênese em Rato Os hepatócitos primária

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus implantável em campo usando amplificação de recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...