Name: determination of self-(in)compatibility and inter-(in)compatibility relationships in citrus using manual pollination, microscopy, and s-genotype analyses
Uploaded: 2023-06-30T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses at JoVE.

Este proyecto fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32122075, 32072523).

1. Preparación para la tinción de azul de anilina
<ol><li>Prepare los siguientes reactivos y herramientas para el experimento: un pincel polinizador, pinzas, un lápiz, papel sulfato, una bolsa de polinización, bolsas con cierre hermético, clips, formaldehído, ácido acético glacial, etanol absoluto, tubos de centrífuga, pinzas, goteros de pegamento, portaobjetos, cubreobjetos, bisturís y polietilenglicol.</li>
	<li>Preparar un medio de germinación in vitro que contenga 0,02% de MgSO4...

<ol>
	<li>Matsumoto, D., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+S-RNases+by+an+S+locus+F-box+like+protein+and+an+S+haplotype-specific+F-box+like+protein+in+the+Prunus-specific+self-incompatibility+system.">Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system.</a> Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).</li><li>Goldberg, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+selection+maintains+self-incompatibility.">Species selection maintains self-incompatibility.</a> Science. 330 (6003), 493-495 (2010).</li><li>Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+on+fruit+quality+of+Guangfeng+Ma+jia+pummelo+and+Pinghe+red+pummelo.">Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo.</a> China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).</li><li>Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+on+self-incompatibility+mechanism+in+fruit+trees.">Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees.</a> Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).</li><li>Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-self-+and+self-recognition+models+in+plant+self-incompatibility.">Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility.</a> Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).</li><li>Meng, X., Sun, P., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-RNase-based+self-incompatibility+in+Petunia+inflata.">S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata.</a> Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).</li><li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+self-compatibility+by+a+mutant+Sm-RNase+in+citrus.">Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus.</a> Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).</li><li>Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-incompatibility+triggers+programmed+cell+death+in+Papaver+pollen.">Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen.</a> Nature. 429, 305-309 (2004).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulated+expression+of+S2-RNase+attenuates+self-incompatibility+in+&amp;#34;Guiyou+No.+1&amp;#34;+pummelo.">Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in &amp;#34;Guiyou No. 1&amp;#34; pummelo.</a> Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).</li><li>Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+selection+in+self-compatible+wild+tobacco+results+from+coordinated+variation+in+homologous+self-Incompatibility+genes.">Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes.</a> Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).</li><li>Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollen+S-locus+F-box+proteins+of+petunia+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility+are+themselves+subject+to+ubiquitin-mediated+degradation.">Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation.</a> The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).</li><li>Hua, Z., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+components+of+a+putative+petunia+S-locus+F-box-containing+E3+ligase+complex+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility.">Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility.</a> Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).</li><li>Entani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-proteasome-mediated+degradation+of+S-RNase+in+a+solanaceous+cross-compatibility+reaction.">Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction.</a> The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).</li><li>Abdallah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+self-incompatibility+and+genetic+diversity+in+diploid+and+hexaploid+plum+genotypes.">Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).</li><li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+production+in+the+new+generation+of+apricot+cultivars:+self-incompatibility,+S-RNase+allele+identification,+and+incompatibility+group+assignment.+.">Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. .</a> Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).</li><li>Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phalaenopsis+pollinia+storage+at+sub-zero+temperature+and+its+pollen+viability+assessment.">Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment.</a> Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).</li><li>Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+evolution+of+genes+related+to+self-incompatibility+in+citrus.">Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus.</a> , (2019).</li><li>Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+protocol+for+genomic+DNA+extraction+from+Citrus+species.">An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+S-genotypes+of+63+pummelo+germplasm+resources.">Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources.</a> Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).</li><li>de Nettancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompatibility+in+angiosperms.">Incompatibility in angiosperms.</a> Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).</li><li>Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+self-incompatibility+and+its+evolutionary+consequences.">Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences.</a> International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).</li><li>Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+pollination+requirements+in+Japanese+plum+by+phenological+monitoring,+hand+pollinations,+fluorescence+microscopy+and+molecular+genotyping.">Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).</li><li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+self-+and+inter-(in)compatibility+relationships+in+apricot+combining+hand-pollination,+microscopy+and+genetic+analyses.">Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).</li></ol>

En los cultivos frutales, tanto la partenocarpia como la IS son rasgos importantes porque allanan el camino para las frutas sin semillas, un rasgo muy apreciado por los consumidores. La autoincompatibilidad promueve el rechazo del autopolen y, por lo tanto, previene la endogamia20. Entre los cítricos, el pummelo es una variedad autoincompatible7. Casi el 40% de todas las especies de angiospermas exhiben SI21. Este rasgo evita el cuajado de la fruta,...

La autoincompatibilidad (IS) es un mecanismo genéticamente controlado presente en aproximadamente el 40% de las especies de angiospermas. En este proceso, el pistilo rechaza el polen de una planta con el mismo genotipo SI y, por lo tanto, impide la autofertilización 1,2. Ma jia pummelo es una variedad local en la provincia de Jinagsu, China, con las excelentes cualidades de fruta grande y rosada, un rico contenido de jugo, un sabor agridulce y una cáscara gruesa3. Aunque la IS promueve el cruzamiento, afecta negativamente el rendimiento y la calidad de las frutas4 y requiere árboles polinizadores adecuados con genotipos IS distintos para tasas confiables de cuajado de frutos y altos rendimientos. En la actualidad, hay dos tipos principales de SI, la autoincompatibilidad esporofítica (SSI), representada por Brassicaceae, y la autoincompatibilidad gametofítica (GSI), representada por Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae y Solanaceae 5,6,7,8.
Los cítricos son uno de los cultivos frutales más importantes del mundo. El sistema GSI basado en S-RNasa se encuentra en muchas accesiones de cítricos e influye negativamente en la tasa de cuajado de frutos9. En este sistema, el SI está controlado por el locus S, un único locus polimórfico con dos alelos complejos que transportan determinantes de pistilo S y determinantes de polen S 7. El determinante femenino es la S ribonucleasa (S-RNasa), y el determinante masculino es el locus S F-box (SLF)7. Las células del pistilo secretan proteínas S-RNasa. Las S-RNasas no propias son reconocidas por las proteínas SLF, lo que conduce a la ubiquitinación y degradación de las S-RNasas no propias por la vía del proteasoma 26S. En contraste, las auto-RNasas S son capaces de acumular e inhibir el crecimiento del tubo polínico (PT) porque evaden las proteínas SLF y, por lo tanto, se les impide la ubiquitinzación10,11,12,13.
Aquí, informamos una técnica in vivo que es útil para identificar genotipos S y grados de compatibilidad e incompatibilidad del polen. El protocolo consiste en extraer ADN total de las hojas y predecir el genotipo S utilizando cebadores específicos de S. Además, la tinción con azul de anilina y la microscopía de fluorescencia seguida de polinización manual proporcionan evidencia del grado de compatibilidad e incompatibilidad. El procedimiento de polinización semi in vivo, que consiste en la polinización manual de flores en el laboratorio14,15, también ha sido adaptado para evaluar los grados de autocompatibilidad e incompatibilidad. Sin embargo, también hemos utilizado la polinización de campo seguida del embolsado de flores para evitar la contaminación del polen no deseado para permitir que los tubos de polen se desarrollen en condiciones naturales. Este protocolo es simple y directo y proporciona la información necesaria para la selección exitosa de árboles polinizadores adecuados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, H3BO3</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10004818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown bottle</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>80029062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal tube</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB</td>
			<td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td>
			<td>57-09-0(CAS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropping</td>
			<td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10009617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automatic sample fast grinder</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td>
			<td>Tissuelyser-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glacial acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10000218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Tube</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10003218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>80109218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>label</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td>Shanghai Leica Co.,Ltd</td>
			<td>21903797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10013018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE Cover glass</td>
			<td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper clips</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pencil</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pollinator brush</td>
			<td>Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, PEG 6000</td>
			<td>Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>DH229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, PEG-4000</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd</td>
			<td>1521GR500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide, KOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10017008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate, KNO3</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10017218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, NAOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfate paper</td>
			<td>Taizhou Jinnong Mesh Factory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat water bath</td>
			<td>Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd</td>
			<td>L-909193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10006818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4</td>
			<td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>20032318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zip lock bags</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td>
			<td>60-24-2(CAS)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of self-(in)compatibility and inter-(in)compatibility relationships in citrus using manual pollination, microscopy, and s-genotype analyses

Los cítricos utilizan la autoincompatibilidad basada en S-RNasa para rechazar el autopolen y, por lo tanto, requieren árboles polinizadores cercanos para una polinización y fertilización exitosas. Sin embargo, la identificación de variedades adecuadas para servir como polinizadores es un proceso que requiere mucho tiempo. Para resolver este problema, hemos desarrollado un método rápido para identificar cultivares de cítricos compatibles con la polinización que utiliza electroforesis en gel de agarosa y tinción de azul de anilina. La compatibilidad del polen se determina en función de la identificación de genotipos S mediante la extracción de ADN total y la realización de ensayos de genotipado basados en PCR con cebadores específicos. Además, los estilos se recolectan 3-4 días después de la polinización manual y se realiza la tinción de azul de anilina. Finalmente, el estado de crecimiento de los tubos polínicos se observa con un microscopio de fluorescencia. La compatibilidad e incompatibilidad del polen se puede establecer observando si el crecimiento del tubo polínico es normal o suprimido, respectivamente. Debido a su simplicidad y rentabilidad, este método es una herramienta eficaz para determinar la compatibilidad e incompatibilidad del polen de diferentes variedades de cítricos para establecer grupos de incompatibilidad y relaciones de incompatibilidad entre diferentes cultivares. Este método proporciona información esencial para la selección exitosa de árboles polinizadores adecuados y, por lo tanto, facilita el establecimiento de nuevos huertos y la selección de padres apropiados para los programas de reproducción.

Para los experimentos realizados aquí, se seleccionaron flores maduras, se recolectaron las anteras, se secaron en un horno y el polen se germinó a 28 ° C durante 12 h. La viabilidad del polen y las tasas de germinación se cuantificaron como se muestra en la Figura 1.
Los cítricos se polinizaron manualmente, y la compatibilidad e incompatibilidad del polen se evaluó mediante tinción de azul de anilina y microscopía de fluorescencia. El polen compatible pod...

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Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Este protocolo proporciona un método rápido para determinar la compatibilidad e incompatibilidad del polen en cultivares de cítricos.

Determinación de las relaciones de autocompatibilidad e intercompatibilidad en cítricos mediante polinización manual, microscopía y análisis de genotipo S

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

Esta técnica puede identificar eficientemente el genotipo S e identificar con precisión la autoincompatibilidad de los cítricos, proporcionando la información necesaria para seleccionar árboles polinizadores adecuados. Esta es una técnica eficiente en el tiempo, simple y confiable para seleccionar los árboles parentales apropiados en los programas de reproducción. Esta técnica es simple y fácil de hacer y hacer experimentos por primera vez necesita paciencia y cuidado.La identificación del genotipo S y el diseño del cebador específico S necesitan más atención y cuidado. Demostrando el procedimiento estará Yu Hu, un estudiante graduado de mi laboratorio. Comience la recolección de polen llevando las flores Majia pomelo, Citrus maxima, al laboratorio.Recoja las anteras con pinzas y colóquelas en una placa de Petri que contenga papel de filtro. Seque los granos de polen colocando la placa de Petri que contiene las anteras en un horno de 28 grados centígrados durante 24 horas. Después del secado, guarde el polen en una bolsa hermética con cierre hermético Micro Centron que contenga gel de sílice que cambia de color.Cierre la bolsa y etiquétela con el nombre de la variedad de polen y la fecha de almacenamiento. Vierta 300 microlitros del medio líquido en la tapa de un tubo de centrífuga de dos mililitros y rocíe el polen uniformemente con la ayuda de un cepillo de polinización. Coloque el polen en una caja negra humidificada e incube a 28 grados centígrados durante 12 horas.Después de la incubación, corte la punta superior de un milímetro de una punta de pipeta de 1.000 microlitros y aspire el polen con una pequeña cantidad de solución de cultivo. Coloque el polen en el centro del portaobjetos del microscopio y cúbralo con un cubreobjetos. Una vez hecho esto, observe la muestra con un microscopio invertido utilizando un objetivo 10X.Realice tres réplicas independientes utilizando aproximadamente la misma densidad de polen para cada réplica. Para la polinización, use un cepillo de polinización para esparcir una cantidad suficiente de polen viable en la superficie del estigma, asegurándose de no dañar el pistilo. Cubra las flores polinizadas con una bolsa de papel sulfato y evite la polinización por pólenes genotípicamente distintos sellando la bolsa con un clip.Escriba el nombre de la especie y el número y el tiempo de polinización en la etiqueta. Cuelgue la etiqueta en las ramas cerca de las flores polinizadas. Retire las bolsas de polinización aproximadamente tres o cuatro días después de la polinización y recoja las flores polinizadas en bolsas con cierre hermético.Retire inmediatamente los pétalos, receptáculos y ovarios de las flores y sumerja el estigma fusionado al estilo en un tubo de centrífuga que contenga una solución fijadora recién preparada. Incubar el estigma y el estilo en la solución fijadora durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, deseche la solución fijadora antes de lavar el estigma y peine dos o tres veces en etanol al 95%.Luego, agregue una solución de etanol al 70% al estilo, asegurándose de que la muestra esté completamente sumergida en la solución. Los estilos en esta etapa se pueden almacenar a cuatro grados centígrados durante uno o dos meses. Para la tinción de azul de anilina, lave las muestras de estilo almacenadas en etanol al 70% con agua destilada de tres a cuatro veces.Sumérjalo en una solución de hidróxido de sodio de cuatro molares y séllelo antes de incubarlo en un baño de agua de 65 grados centígrados durante 60 minutos. Durante este paso, el color del estilo cambia de amarillo-blanco a naranja-rojo. A continuación, remoje los estilos en agua destilada.Después de 30 minutos, deseche el agua destilada y lave los estilos con agua destilada de tres a cuatro veces o hasta que el color del estilo se vuelva amarillo. Luego, agregue el azul de anilina hasta que la muestra se sumerja e incube durante 12 horas en la oscuridad. Observe el crecimiento del tubo polínico bajo el microscopio de fluorescencia.Coloque la diapositiva sobre una mesa plana. Divide el estilo en dos mitades a lo largo del eje longitudinal con un bisturí. Coloque la mitad del estilo en un portaobjetos de vidrio y agregue de dos a tres gotas de polietilenglicol a la superficie del portaobjetos.Luego, cúbralo con un cubierto. Una vez hecho esto, coloque el portaobjetos en la plataforma del microscopio por encima de la abertura y visualice usando un objetivo 10X. Utilice el filtro DAPI y observe el crecimiento del tubo polínico.Observe cinco estilos para cada tipo de polinización. La viabilidad polínica de Citrus maxima y las tasas de germinación se cuantificaron mediante microscopía fluorescente. El polen compatible germinó con éxito en la superficie del estigma y produjo un tubo polínico normal, que creció y finalmente condujo a la fertilización en el ovario.En contraste, los tubos de polen incompatibles crecieron a través de aproximadamente 2/3 del estilo y luego dejaron de crecer. La electroforesis en gel de agarosa detectó el producto de ADN amplificado utilizando los cebadores específicos del locus S. Mostró la amplificación del producto de ADN entre 500 y 1.000 pares de bases.Se identificó el genotipo S correspondiente. Se identificaron 21 haplotipos S en diferentes especies de cítricos utilizando este método. El paso de polinización es crítico.Solo la polinización exitosa puede garantizar la observación posterior de los tubos de polen. La técnica se utilizó para analizar los rasgos de autoincompatibilidad y para explorar e identificar los determinantes femeninos de la autoincompatibilidad. Este método es importante para la investigación de la autoincompatibilidad y los programas de mejoramiento.También puede facilitar a la comunidad agrícola la selección de árboles polinizadores para sus huertos.

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Investigación

Biología

Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats

Sujeción manual y de las rutas de la administración del compuesto en ratones y ratas

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research.  Working confidently and humanely with mice and ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Evisceración de vítreo y retina del ratón para análisis proteómico

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Proteína localización usando la foto activada por microscopía de localización y Microscopía Electrónica

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

El uso de alta resolución de tomografía computarizada para visualizar la estructura tridimensional y la función de la Planta Vasculatura

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Analizando Craneofacial en la morfogénesis de pez cebra Utilizando 4D Microscopía Confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

La medición de la rigidez de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Detección de Candidatus Liberibacter asiaticus desplegable en campo mediante amplificación de polimerasa recombinasa combinada con CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...