Name: determination of self-(in)compatibility and inter-(in)compatibility relationships in citrus using manual pollination, microscopy, and s-genotype analyses
Uploaded: 2023-06-30T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses at JoVE.

Bu proje Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32122075, 32072523) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.

1. Anilin mavisi boyama için hazırlık
<ol><li>Deney için aşağıdaki reaktifleri ve araçları hazırlayın: tozlayıcı fırça, cımbız, kurşun kalem, sülfat kağıdı, tozlaşma torbası, fermuarlı kilit torbaları, ataşlar, formaldehit, buzul asetik asit, mutlak etanol, santrifüj tüpleri, forseps, tutkal damlalıkları, cam slaytlar, örtüler, neşterler ve polietilen glikol.</li>
	<li>% 0.02 MgSO4,% 0.01 KNO 3,% 0.03 Ca (NO 3)2,% 0.01 H 3 BO...

<ol>
	<li>Matsumoto, D., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+S-RNases+by+an+S+locus+F-box+like+protein+and+an+S+haplotype-specific+F-box+like+protein+in+the+Prunus-specific+self-incompatibility+system.">Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system.</a> Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).</li><li>Goldberg, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+selection+maintains+self-incompatibility.">Species selection maintains self-incompatibility.</a> Science. 330 (6003), 493-495 (2010).</li><li>Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+on+fruit+quality+of+Guangfeng+Ma+jia+pummelo+and+Pinghe+red+pummelo.">Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo.</a> China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).</li><li>Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+on+self-incompatibility+mechanism+in+fruit+trees.">Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees.</a> Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).</li><li>Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-self-+and+self-recognition+models+in+plant+self-incompatibility.">Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility.</a> Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).</li><li>Meng, X., Sun, P., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-RNase-based+self-incompatibility+in+Petunia+inflata.">S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata.</a> Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).</li><li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+self-compatibility+by+a+mutant+Sm-RNase+in+citrus.">Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus.</a> Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).</li><li>Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-incompatibility+triggers+programmed+cell+death+in+Papaver+pollen.">Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen.</a> Nature. 429, 305-309 (2004).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulated+expression+of+S2-RNase+attenuates+self-incompatibility+in+&amp;#34;Guiyou+No.+1&amp;#34;+pummelo.">Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in &amp;#34;Guiyou No. 1&amp;#34; pummelo.</a> Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).</li><li>Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+selection+in+self-compatible+wild+tobacco+results+from+coordinated+variation+in+homologous+self-Incompatibility+genes.">Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes.</a> Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).</li><li>Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollen+S-locus+F-box+proteins+of+petunia+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility+are+themselves+subject+to+ubiquitin-mediated+degradation.">Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation.</a> The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).</li><li>Hua, Z., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+components+of+a+putative+petunia+S-locus+F-box-containing+E3+ligase+complex+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility.">Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility.</a> Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).</li><li>Entani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-proteasome-mediated+degradation+of+S-RNase+in+a+solanaceous+cross-compatibility+reaction.">Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction.</a> The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).</li><li>Abdallah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+self-incompatibility+and+genetic+diversity+in+diploid+and+hexaploid+plum+genotypes.">Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).</li><li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+production+in+the+new+generation+of+apricot+cultivars:+self-incompatibility,+S-RNase+allele+identification,+and+incompatibility+group+assignment.+.">Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. .</a> Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).</li><li>Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phalaenopsis+pollinia+storage+at+sub-zero+temperature+and+its+pollen+viability+assessment.">Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment.</a> Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).</li><li>Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+evolution+of+genes+related+to+self-incompatibility+in+citrus.">Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus.</a> , (2019).</li><li>Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+protocol+for+genomic+DNA+extraction+from+Citrus+species.">An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+S-genotypes+of+63+pummelo+germplasm+resources.">Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources.</a> Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).</li><li>de Nettancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompatibility+in+angiosperms.">Incompatibility in angiosperms.</a> Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).</li><li>Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+self-incompatibility+and+its+evolutionary+consequences.">Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences.</a> International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).</li><li>Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+pollination+requirements+in+Japanese+plum+by+phenological+monitoring,+hand+pollinations,+fluorescence+microscopy+and+molecular+genotyping.">Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).</li><li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+self-+and+inter-(in)compatibility+relationships+in+apricot+combining+hand-pollination,+microscopy+and+genetic+analyses.">Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).</li></ol>

Meyve bitkilerinde, hem partenokarpi hem de SI önemli özelliklerdir, çünkü çekirdeksiz meyvelerin yolunu açarlar - tüketiciler tarafından çok takdir edilen bir özellik. Kendi kendine uyumsuzluk, kendi kendine polenin reddedilmesini teşvik eder ve böylece akrabalığı önler20. Narenciye arasında, pummelo kendi kendine uyumsuz bir çeşittir7. Tüm anjiyosperm türlerinin neredeyse% 40'ı SI21 sergiler. Bu özellik meyve tutumunu önler...

Kendine uyumsuzluk (SI), anjiyosperm türlerinin yaklaşık %40'ında bulunan genetik olarak kontrol edilen bir mekanizmadır. Bu süreçte, pistil aynı SI genotipine sahip bir bitkiden poleni reddeder ve böylece kendi kendine döllenmeyi önler 1,2. Ma jia pummelo, Çin'in Jinagsu eyaletinde, büyük, pembe meyve, zengin meyve suyu içeriği, tatlı ve ekşi bir tat ve kalın bir kabuğun mükemmel nitelikleri ile yerel bir çeşittir3. SI, geçişi teşvik etmesine rağmen, meyvelerin verimini ve kalitesini olumsuz yönde etkiler4 ve güvenilir meyve tutum oranları ve yüksek verim için farklı SI genotiplerine sahip uygun tozlaştırıcı ağaçlar gerektirir. Şu anda, Brassicaceae tarafından temsil edilen sporofitik öz uyumsuzluk (SSI) ve Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae ve Solanaceae 5,6,7,8 tarafından temsil edilen gametofitik öz uyumsuzluk (GSI) olmak üzere iki ana SI türü vardır.
Narenciye dünyanın en önemli meyve bitkilerinden biridir. S-RNaz bazlı GSI sistemi birçok narenciye katılımında bulunur ve meyve verme oranını olumsuz yönde etkiler9. Bu sistemde SI, pistil S determinantlarını ve polen S determinantlarını taşıyan iki karmaşık aleli olan tek bir polimorfik lokus olan S lokusu tarafından kontrol edilir7. Dişi determinant S ribonükleazdır (S-RNase) ve erkek determinant S lokus F-kutusu (SLF)7'dir. Pistilin hücreleri S-RNaz proteinlerini salgılar. Kendinden olmayan S-RNazlar, SLF proteinleri tarafından tanınır, bu da 26S proteazom yolu tarafından kendinden olmayan S-RNazların ubikitinasyonuna ve bozulmasına yol açar. Buna karşılık, kendi kendine S-RNazlar polen tüpü (PT) büyümesini biriktirebilir ve inhibe edebilir, çünkü SLF proteinlerinden kaçınırlar ve bu nedenle ubikitinzasyondan 10,11,12,13 önlenirler.
Burada, S-genotiplerini ve polen uyumluluğu ve uyumsuzluğunun derecelerini tanımlamak için yararlı olan bir in vivo tekniği sunuyoruz. Protokol, yapraklardan toplam DNA'nın çıkarılmasını ve S'ye özgü primerler kullanılarak S genotipinin tahmin edilmesini içerir. Ayrıca, anilin mavisi boyama ve floresan mikroskobu ve ardından el tozlaşması, uyumluluk ve uyumsuzluk derecesi için kanıt sağlar. Laboratuarda çiçeklerin manuel olarak tozlaşmasını içeren yarı in vivo tozlaşma prosedürü14,15, kendi kendine uyumluluk ve uyumsuzluk derecelerini değerlendirmek için de uyarlanmıştır. Bununla birlikte, polen tüplerinin doğal koşullarda gelişmesine izin vermek için istenmeyen polenlerden kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için tarla tozlaşmasını ve ardından çiçeklerin torbalanmasını da kullandık. Bu protokol basit ve anlaşılırdır ve uygun tozlaştırıcı ağaçların başarılı bir şekilde seçilmesi için gerekli bilgileri sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, H3BO3</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10004818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown bottle</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>80029062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal tube</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB</td>
			<td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td>
			<td>57-09-0(CAS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropping</td>
			<td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10009617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automatic sample fast grinder</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td>
			<td>Tissuelyser-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glacial acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10000218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Tube</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10003218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>80109218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>label</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td>Shanghai Leica Co.,Ltd</td>
			<td>21903797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10013018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE Cover glass</td>
			<td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper clips</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pencil</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pollinator brush</td>
			<td>Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, PEG 6000</td>
			<td>Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>DH229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, PEG-4000</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd</td>
			<td>1521GR500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide, KOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10017008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate, KNO3</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10017218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, NAOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfate paper</td>
			<td>Taizhou Jinnong Mesh Factory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat water bath</td>
			<td>Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd</td>
			<td>L-909193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10006818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4</td>
			<td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>20032318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zip lock bags</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td>
			<td>60-24-2(CAS)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of self-(in)compatibility and inter-(in)compatibility relationships in citrus using manual pollination, microscopy, and s-genotype analyses

Narenciye, kendi kendine poleni reddetmek için S-RNaz bazlı kendi kendine uyumsuzluğu kullanır ve bu nedenle başarılı tozlaşma ve gübreleme için yakındaki tozlaştırıcı ağaçları gerektirir. Bununla birlikte, tozlaştırıcı olarak hizmet etmek için uygun çeşitlerin belirlenmesi zaman alıcı bir süreçtir. Bu sorunu çözmek için, agaroz jeli elektroforezi ve anilin mavisi boyama kullanan tozlaşma uyumlu narenciye çeşitlerini tanımlamak için hızlı bir yöntem geliştirdik. Polen uyumluluğu, toplam DNA'nın çıkarılması ve spesifik primerlerle PCR tabanlı genotipleme testlerinin yapılması ile S genotiplerinin tanımlanmasına dayanarak belirlenir. Ek olarak, stiller manuel tozlaşmadan 3-4 gün sonra toplanır ve anilin mavisi boyama yapılır. Son olarak, polen tüplerinin büyüme durumu floresan mikroskobu ile gözlemlenir. Polen uyumluluğu ve uyumsuzluğu, polen tüpü büyümesinin sırasıyla normal mi yoksa baskılanmış mı olduğu gözlemlenerek belirlenebilir. Sadeliği ve maliyet etkinliği nedeniyle, bu yöntem, farklı çeşitler arasında uyumsuzluk grupları ve uyumsuzluk ilişkileri kurmak için farklı narenciye çeşitlerinin polen uyumluluğunu ve uyumsuzluğunu belirlemek için etkili bir araçtır. Bu yöntem, uygun tozlaştırıcı ağaçların başarılı bir şekilde seçilmesi için gerekli bilgileri sağlar ve böylece yeni meyve bahçelerinin kurulmasını ve ıslah programları için uygun ebeveynlerin seçilmesini kolaylaştırır.

Burada yapılan deneyler için olgun çiçekler seçildi, anterler toplandı, bir fırında kurutuldu ve polenler 12 saat boyunca 28 ° C'de çimlendi. Polen canlılığı ve çimlenme oranları Şekil 1'de gösterildiği gibi ölçülmüştür.
Narenciye manuel olarak tozlaştırıldı ve polen uyumluluğu ve uyumsuzluğu anilin mavisi boyama ve floresan mikroskobu kullanılarak değerlendirildi. Uyumlu polen, stigmanın yüzeyinde çimlenebilir ve büyüyebilece...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses at JoVE.

Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Bu protokol, narenciye çeşitlerinde polen uyumluluğunu ve uyumsuzluğunu belirlemek için hızlı bir yöntem sağlar.

Manuel Polinasyon, Mikroskopi ve S-Genotip Analizleri Kullanılarak Narenciyede Kendini-(In)uyumluluk, Uyumluluk-(In)uyumluluklarının ve Inter-(In)uyumluluklarının belirlenmesi

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

Bu teknik, S genotipini etkili bir şekilde tanımlayabilir ve narenciye öz uyumsuzluğunu doğru bir şekilde tanımlayabilir ve uygun polenleştirici ağaçlarının seçilmesi için gerekli bilgileri sağlayabilir. Bu, ıslah programlarında uygun ebeveyn ağaçlarını seçmek için zaman verimli, basit ve güvenilir bir tekniktir. Bu tekniğin yapılması basit ve kolaydır ve ilk kez deney yapmak sabır ve özen gerektirir.S genotipinin tanımlanması ve S'ye özgü astar tasarımı daha fazla dikkat ve özen gerektirir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi olan Yu Hu olacak. Polen toplamaya Majia pomelo, Citrus maxima, çiçekleri laboratuvara götürerek başlayın.Anterleri cımbız kullanarak toplayın ve filtre kağıdı içeren bir Petri kabına yerleştirin. Anterleri içeren Petri kabını 24 saat boyunca 28 santigrat derecelik bir fırına koyarak polen tanelerini kurutun. Kuruduktan sonra, poleni renk değiştiren silika jel içeren Micro Centron hava geçirmez fermuarlı kilitli bir torbada saklayın.Torbayı kapatın ve torbayı polen çeşidinin adı ve depolama tarihi ile etiketleyin. İki mililitrelik bir santrifüj tüpünün kapağına 300 mikrolitre sıvı ortam dökün ve poleni bir tozlaşma fırçası yardımıyla eşit şekilde serpin. Polenleri nemlendirilmiş bir kara kutuya yerleştirin ve 12 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin.Kuluçkadan sonra, üst bir milimetrelik ucu 1.000 mikrolitrelik pipet ucundan kesin ve poleni az miktarda kültür çözeltisi ile aspire edin. Polenleri mikroskop slaytının ortasına yerleştirin ve bir kapak kayması ile örtün. İşiniz bittiğinde, 10X hedefi kullanarak ters çevrilmiş bir mikroskopla numuneyi gözlemleyin.Her replika için yaklaşık olarak aynı polen yoğunluğunu kullanarak üç bağımsız replika gerçekleştirin. Tozlaşma için, yeterli miktarda canlı poleni stigmanın yüzeyine yaymak için bir tozlaşma fırçası kullanın ve pistile zarar vermediğinizden emin olun. Tozlaşan çiçekleri bir sülfat kağıt torba ile örtün ve torbayı bir ataş kullanarak kapatarak genotipik olarak farklı polenler tarafından tozlaşmayı önleyin.Etikete türlerin adını ve tozlaşma sayısını ve zamanını yazın. Etiketi tozlaşmış çiçeklerin yakınındaki dallara asın. Tozlaşmadan yaklaşık üç ila dört gün sonra tozlaşma torbalarını çıkarın ve tozlaşan çiçekleri fermuarlı kilit torbalarında toplayın.Yaprakları, kapları ve yumurtalıkları çiçeklerden derhal çıkarın ve stilize etmek için kaynaşmış damgalamayı taze hazırlanmış bir fiksatif çözelti içeren bir santrifüj tüpüne batırın. Fiksatif çözeltideki damgalama ve stili gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, stigmayı yıkamadan önce fiksatif çözeltiyi atın ve % 95 etanol içinde iki ila üç kez şekillendirin.Ardından, stile% 70 etanol çözeltisi ekleyerek numunenin çözeltiye tamamen daldırılmasını sağlayın. Bu aşamadaki stiller bir ila iki ay boyunca dört santigrat derecede saklanabilir. Anilin mavisi boyama için,% 70 etanol içinde saklanan stil örneklerini damıtılmış suyla üç ila dört kez yıkayın.Dört molar sodyum hidroksit çözeltisine daldırın ve 60 dakika boyunca 65 santigrat derecelik bir su banyosunda inkübe etmeden önce kapatın. Bu adımda, stilin rengi sarı-beyazdan turuncu-kırmızıya değişir. Ardından, stilleri damıtılmış suya batırın.30 dakika sonra, damıtılmış suyu atın ve stilleri damıtılmış suyla üç ila dört kez veya stilin rengi sarı olana kadar yıkayın. Ardından, numune suya batırılana kadar anilin mavisini ekleyin ve karanlıkta 12 saat boyunca inkübe edin. Polen tüpü büyümesini floresan mikroskobu altında gözlemleyin.Slaytı düz bir masaya yerleştirin. Bir neşter kullanarak stili uzunlamasına eksen boyunca iki yarıya bölün. Stilin bir yarısını bir cam slayta yerleştirin ve slaytın yüzeyine iki ila üç damla polietilen glikol ekleyin.Ardından, bir kapak fişi ile örtün. İşiniz bittiğinde, slaytı diyafram açıklığının üzerindeki mikroskop aşamasına yerleştirin ve 10X'lik bir hedef kullanarak görselleştirin. DAPI filtresini kullanın ve polen tüpü büyümesini gözlemleyin.Her tozlaşma türü için beş stile dikkat edin. Citrus maxima'nın polen canlılığı ve çimlenme oranları floresan mikroskopi kullanılarak ölçüldü. Uyumlu polen, stigmanın yüzeyinde başarılı bir şekilde çimlendi ve normal bir polen tüpü üretti, bu da büyüdü ve sonuçta yumurtalıkta döllenmeye yol açtı.Buna karşılık, uyumsuz polen tüpleri stilin yaklaşık 2 / 3'ü boyunca büyüdü ve daha sonra büyümeyi durdurdu. Agaroz jel elektroforezi, S lokusuna özgü primerler kullanılarak güçlendirilmiş DNA ürününü tespit etti. DNA ürününün 500 ila 1.000 baz çifti arasında amplifikasyonunu gösterdi.Karşılık gelen S genotipi tanımlandı. Bu yöntem kullanılarak farklı narenciye türlerinde 21 S haplotipi tanımlanmıştır. Tozlaşma adımı kritiktir.Sadece başarılı tozlaşma, polen tüplerinin daha sonra gözlemlenmesini sağlayabilir. Teknik, öz-uyumsuzluk özelliklerini analiz etmek ve öz-uyumsuzluğun kadın belirleyicilerini araştırmak ve tanımlamak için kullanılmıştır. Bu yöntem, kendi kendine uyumsuzluk araştırma ve ıslah programları için önemlidir.Ayrıca, çiftçi topluluğunun meyve bahçeleri için polenleştirici ağaçları seçmesini kolaylaştırabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Biyoloji

Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats

Manuel Tutucu ve Fare ve Sıçanlarda Ortak Bileşik İdaresi Rotalar

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research.  Working confidently and humanely with mice and ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Proteomik Analizleri Fare Vitreus ve Retina eviserasyon

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Bitki damarları ve Üç Boyutlu Yapı ve Fonksiyon Visualize&#39;a Yüksek Çözünürlüklü Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

CRISPR-Cas12a ile Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu Kullanılarak Sahada Konuşlandırılabilir Candidatus Liberibacter asiaticus Tespiti

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...