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March 31st, 2023
DOI :
March 31st, 2023
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Introduction
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Sample Embedding
3:13
Sectioning
4:41
Labeling and Light Microscopy
9:18
Results: Correlative Light-EM of LC3 and LAMP1 in Starved HEPG2 Cells
11:16
Conclusion
Transcript
सेल की अल्ट्रास्ट्रक्चर के संदर्भ में प्रोटीन का स्थानीयकरण दशकों से एक शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण रहा है। इस प्रोटोकॉल के साथ, हमने प्रोटीन का विस्तार किया जो बहुतायत में कम हैं या पता लगाना मुश्किल है। हम एक संवेदनशील और स्क्रीन करने योग्य तरीके से प्रोटीन को लेबल करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं और सेल की अल्ट्रास्ट्रक्चर को फिर से भरने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ जोड़ते हैं।
यहां हम ऑटोफैगी प्रोटीन पर ऑन-सेक्शन सीएलईएम का प्रदर्शन करेंगे, लेकिन इसे वास्तव में किसी भी जैविक प्रश्न पर लागू किया जा सकता है जहां सेल की अल्ट्रास्ट्रक्चर रुचि रखती है, खासकर दुर्लभ घटनाओं के अध्ययन में। मेरे साथ प्रक्रिया का प्रदर्शन हमारी प्रयोगशाला के एक वरिष्ठ शोध तकनीशियन टिनेके वीनेंडल होंगे। शुरू करने के लिए, पीबीएस में 0.15% ग्लाइसिन युक्त पीबीएस को 1% जिलेटिन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
जिलेटिन में कोशिकाओं को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में खरोंच और स्थानांतरित करें। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए 6,000 जी पर कोशिकाओं को पेलेट करें और फिर गोली को परेशान किए बिना जिलेटिन को हटा दें। 12% जिलेटिन को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके गोली में डालें और पिपेट टिप्स या ग्लास चरागाह पिपेट के साथ उसी तापमान पर गर्म करके धीरे से पुन: निलंबित करें।
10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और फिर एक मिनट के लिए 6,000 जी पर कोशिकाओं को पेलेट करें। जिलेटिन को 30 मिनट के लिए बर्फ पर ठोस करें। ट्यूब से जिलेटिन एम्बेडेड कोशिकाओं को हटाने के लिए, पेलेट युक्त ट्यूब के अंत को रेजर ब्लेड से ट्यूब के बाकी हिस्सों से काट लें।
फिर ट्यूब के अंत को सेल गोली के साथ पहले कट के लंबवत आधे में काट लें। सेल गोली वाले दो ट्यूब एंड हिस्सों को 2.3 मोलर सुक्रोज में रखें और चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इससे सेल पेलेट हाफ थोड़ा सिकुड़ जाता है और प्लास्टिक ट्यूब से हट जाता है।
सुक्रोज से जिलेटिन एम्बेडेड सेल गोली के साथ ट्यूब हाफ को हटा दें, और फिर चिमटी के साथ प्लास्टिक ट्यूब हाफ से सेल पेलेट हाफ को हटा दें। मैन्युअल रूप से पेलेट को रेजर ब्लेड के साथ उचित आकार के ब्लॉकों में काटें, और काटने के दौरान विषय को बढ़ाने के लिए एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। सेल ब्लॉक को रात भर 2.3 मोलर सुक्रोज में चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
उन्हें एल्यूमीनियम नमूना धारक पिन पर रखें। ब्लॉक के किनारों के चारों ओर पर्याप्त सुक्रोज छोड़ दें ताकि यह ब्लॉक और पिन के बीच एक पतला कॉलर बना सके। इसे फ्रीज करें और तरल नाइट्रोजन में स्टोर करें।
लगभग 250 नैनोमीटर मोटे खंड प्राप्त करने के लिए इसकी सतह को समतल करने के लिए ब्लॉक के सामने के हिस्से को ट्रिम करें। फिर चाकू के कोने के साथ नमूना ब्लॉक चेहरे के किनारे में 50 से 100 माइक्रोमीटर को विभाजित करके ब्लॉक के किनारों को ट्रिम करें। नमूना ब्लॉक चेहरे के चार किनारों को ट्रिम करने से लगभग 250 बाय 375 माइक्रोमीटर आयत बन जाएगा।
उभरे हुए आयत से एक रिबन खंड यह सुनिश्चित करता है कि खंड मोटाई में 70 से 90 नैनोमीटर के बीच हैं और इसमें चांदी की सुनहरी चमक है। एक लंबा रिबन बनाने के लिए एक छड़ी पर बालों के साथ हीरे के चाकू के किनारे से दूर अनुभागों का मार्गदर्शन करें। तीन मिलीमीटर पिकअप लूप को 2.3 मोलर सुक्रोज और 2% मिथाइलसेल्यूलोज के एक-से-एक मिश्रण में डुबोकर रिबन उठाएं।
लूप को माइक्रोटोम के क्रायो चैंबर में डालें, और एक बार जब बूंद जमने लगे, तो तुरंत उनके खिलाफ बूंद को धीरे से दबाकर वर्गों को उठाएं। क्रायो कक्ष से लूप को हटा दें। बूंद पूरी तरह से पिघलने तक प्रतीक्षा करें और बूंद को तैयार ग्रिड पर दबाएं।
एक छोटी डिश या मल्टी-वेल प्लेट में पीबीएस के लगभग एक मिलीलीटर पर खंडों के साथ ग्रिड रखें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। पैराफिल्म पर लगभग 75 माइक्रोलीटर बूंदों पर ग्रिड को संसाधित करें और कमरे के तापमान पर पीबीएस ग्लाइसिन वॉश से शुरू करें। ब्लॉकिंग स्टेप के रूप में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन सी और 0.5% फिश स्किन जिलेटिन से बने ब्लॉकिंग बफर के साथ ग्रिड को इनक्यूबेट करें।
पीबीएस में बफर को अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें और कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए इस समाधान की लगभग 10 माइक्रोलीटर बूंदों पर ग्रिड को इनक्यूबेट करें। कमरे के तापमान पर पांच बार पीबीएस में 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन में ग्रिड धोएं। पीबीएस में ब्लॉकिंग बफर में द्वितीयक एंटीबॉडी और डीएपीआई को पतला करें।
फिर पीबीएस में ग्रिड को पांच बार धोने से पहले कमरे के तापमान पर 30 मिनट या उससे अधिक समय तक इस घोल की लगभग 10 माइक्रोलीटर बूंदों पर ग्रिड को इनक्यूबेट करें। प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए नमूने माउंट करने के लिए, ग्रिड को 50% ग्लिसरॉल में आसुत जल में कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए दो बार डुबोएं। एक ग्लास स्लाइड और 50% ग्लिसरॉल में एक कवर स्लिप के बीच प्रति कवर स्लिप एक ग्रिड रखें, यह सुनिश्चित करें कि अनुभाग कवर स्लिप का सामना कर रहे हैं।
प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए, सैंडविच ग्रिड के साथ एक ग्लास स्लाइड को एक स्वचालित चरण के साथ एक विस्तृत क्षेत्र माइक्रोस्कोप में ले जाएं। एक उच्च आवर्धन तेल उद्देश्य का चयन करें और अनुभागों के रिबन का एक छवि टाइल सेट बनाएं। इसके बाद, अनमाउंटिंग और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या ईएम कंट्रास्टिंग के लिए, ग्लास स्लाइड कवर स्लिप सैंडविच के किनारे 10 माइक्रोलीटर आसुत जल जोड़ें, और ग्लास कवर स्लिप सैंडविच इंटरफ़ेस को भरने के लिए केशिका कार्रवाई की प्रतीक्षा करें।
ग्लिसरॉल में विसर्जन तेल को मिलाए बिना कवर स्लिप को ध्यान से हटा दें। चिमटी के साथ ग्रिड को पुनः प्राप्त करें और उन्हें 50% ग्लिसरॉल को धोने के लिए कमरे के तापमान पर तीन बार आसुत जल में डुबोएं। ग्रिड के पिछले हिस्से को लिंट-फ्री टिशू पेपर से सावधानीपूर्वक सुखाएं और ग्रिड सेक्शन को डिस्टिल्ड वॉटर ड्रॉपलेट्स पर रखें।
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में कंट्रास्ट के लिए अनुभागों को दागने के लिए, उन्हें कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए यूरिनिल एसीटेट के साथ इनक्यूबेट करें। बर्फ पर धातु की प्लेट पर पैराफिल्म पर बूंदों को रखकर यूरिनल एसीटेट मिथाइलसेल्यूलोज समाधान को ठंडा करें। फिर इस बर्फ के ठंडे घोल से ग्रिड्स को दो बार धोएं और 10 मिनट के लिए घोल में इनक्यूबेट करें।
प्रत्येक ग्रिड के नीचे यूरिनल एसीटेट मिथाइलसेल्यूलोज बूंद में एक ग्रिड सुखाने वाला लूप डालकर ग्रिड को लूप करें और धीरे से इसे तब तक उठाएं जब तक कि ग्रिड बूंद से खींच न जाए। अतिरिक्त घोल को ब्लॉट करने के लिए, लूप को लिंट-फ्री फिल्टर पेपर पर लगभग 60 डिग्री कोण पर स्पर्श करें और इसे धीरे-धीरे पेपर के साथ खींचें जब तक कि कोई और समाधान अवशोषित न हो जाए। लूप को ग्रिड के साथ एक उपयुक्त रैक में रखें, और इसे 10 मिनट से अधिक समय तक कमरे के तापमान पर सूखने दें।
ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप या टीईएम में इमेजिंग के लिए रुचि के क्षेत्र का पता लगाने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त अवलोकन का उपयोग करें, और प्रकाश माइक्रोस्कोपी डेटासेट पर आरओआई को एनोटेट करें। एक बार एक क्षेत्र का चयन हो जाने के बाद, TEM में 20,000x से 50,000x आवर्धन पर एक छवि टाइल सेट प्राप्त करें। पोस्ट-प्रोसेसिंग सॉफ़्टवेयर में छवि टाइल सेट का पुनर्निर्माण करें।
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में DAPI सिग्नल और प्रतिदीप्ति और परमाणु रूपरेखा के आधार पर सहसंबंध करें। छवियों को ठीक से ओवरले करने के लिए स्थानांतरित करें और मैन्युअल सहसंबंध को सटीक रूप से निष्पादित करें। हेपेटोब्लास्टोमा व्युत्पन्न एचईपीजी 2 कोशिकाओं को दो घंटे के लिए 4% पैराल्डिहाइड के साथ निर्धारण से पहले ईबीएसएस में दो घंटे तक भूखा रखा गया था।
अनुभागों पर एलसी 3 और एलएएमपी 1 की आईएफ इमेजिंग से अपेक्षाकृत कम एलसी 3 पंक्टा और एलएएमपी 1 के साथ थोड़ा सह-स्थानीयकरण का पता चलता है। आईएफ से आणविक जानकारी को डीएपीआई और परमाणु रूपरेखा के आधार पर दो इमेजिंग तौर-तरीकों को खत्म करके इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में प्राप्त अल्ट्रा संरचनात्मक जानकारी से जोड़ा गया था। एलसी 3 पॉजिटिव ऑर्गेनेल के ईएम अल्ट्रास्ट्रक्चर से सहसंबंध से पता चला है कि अलग-अलग पंक्टा ऑटोफैगी के अलग-अलग चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
बॉक्स एक द्वारा उदाहरण के रूप में व्यक्तिगत एलसी 3 लेबल डिब्बों की अल्ट्रास्ट्रक्चर यहां दिखाया गया है। कोररिलेटिव लाइट इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों को बाईं ओर दिखाया गया है, और छद्म रंगीन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों को दाईं ओर दिखाया गया है। आंतरिक और बाहरी ऑटोफैगोसोमल झिल्ली को सफेद और काले तीर के तीर द्वारा इंगित किया जाता है।
दिलचस्प बात यह है कि ईएम ने एलसी 3 पॉजिटिव ऑटोलाइसोसोम के रूप में अपेक्षाकृत कमजोर फ्लोरोसेंट स्पॉट की पहचान की, जो घने सामग्री और इंट्राल्यूमिनल पुटिकाओं की विशेषता है। यह अल्ट्रा थिन क्रायो वर्गों के आईएफ में न्यूनतम एलसी 3 दृश्यता का खुलासा करता है, जो विघटनकारी वातावरण के बावजूद स्थिर अवस्था ऑटोलाइसोसोम में पता लगाने योग्य एलसी 3 का सुझाव देता है। हालांकि, एलसी 3 पॉजिटिव पंक्टा मुख्य रूप से ऑटोफैगोसोम का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसमें कुछ ऑटोलाइसोसोम का प्रतिनिधित्व करते हैं।
शोधकर्ताओं के लिए जो ऑन-सेक्शन सीएलईएम के बजाय इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग करना चाहते हैं, यहां वर्णित प्रोटोकॉल और टिप्स इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग के लिए भी पूरी तरह से लागू होते हैं। हमने शुरू में कम प्रचुरता के एंडोसोमल नियामक प्रोटीन के लिए ऑन-सेक्शन सीएलईएम लागू किया और पहली बार दिखाया, उनके अंतर्जात अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्थानीयकरण।
यहां, हम सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर के संबंध में दुर्लभ प्रोटीन के स्थानीयकरण की जांच करने के लिए एक उपकरण के रूप में अंतर्जात, फ्लोरोसेंट लेबलिंग के आधार पर अनुकूलित ऑन-सेक्शन कोररिलेटिव लाइट-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस दृष्टिकोण की शक्ति को बेफिलोमाइसिन उपचार के बिना भूखे कोशिकाओं में अंतर्जात एलसी 3 के अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्थानीयकरण द्वारा प्रदर्शित किया जाता है।
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