Name: high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle
Uploaded: 2023-02-03T14:40:00
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Les auteurs tiennent à souligner le généreux soutien de la Chaire John et Debbie Oxley en médecine sportive équine et de la Fondation de recherche du Grayson Jockey Club.

Cette étude a été approuvée par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Oklahoma State University. Quatre hongres pur-sang (17,5 ± 1,3 ans, 593 ± 45 kg) ont été utilisés dans cette étude pour générer les résultats représentatifs.
1. Obtention d’un échantillon de biopsie des muscles squelettiques
<ol><li>Obtenir des biopsies des muscles squelettiques (suivre une technique stérile) à partir du centre du muscle semi-tendineux (...

<ol>
	<li>Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+muscle+approaching+maximal+rates+of+oxygen+utilization.">Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization.</a> Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , (2014).</li><li>Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+can+be+determined+in+individual+cells+from+the+nernstian+distribution+of+cationic+dyes.">Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes.</a> Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).</li><li>Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ADP-ATP+exchange+in+relation+to+mitochondrial+transmembrane+potential+and+oxygen+consumption.">Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).</li><li>Krumschnabel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).</li><li>Lemieux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+is+altered+in+horse+atypical+myopathy.">Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy.</a> Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).</li><li>Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+muscle+mitochondrial+respiratory+capacity+in+Standardbred+racehorses+as+an+aid+to+predicting+exertional+rhabdomyolysis.">Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis.</a> Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).</li><li>Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+fitness+and+mitochondrial+respiratory+capacity+in+horse+skeletal+muscle.">Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).</li><li>Votion, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+mitochondrial+respiratory+function+in+response+to+endurance+training+and+endurance+racing.">Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing.</a> Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).</li><li>Tosi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+capacity+in+horses+suffering+from+polysaccharide+storage+myopathy.">Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).</li><li>Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hyperthermia+and+acidosis+on+equine+skeletal+muscle+mitochondrial+oxygen+consumption.">Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption.</a> Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).</li><li>Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAPID+COMMUNICATION:+Differential+skeletal+muscle+mitochondrial+characteristics+of+weanling+racing-bred+horses1.">RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1.</a> Journal of Animal Science. , (2019).</li><li>White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submaximal+exercise+training+improves+mitochondrial+efficiency+in+the+gluteus+medius+but+not+in+the+triceps+brachii+of+young+equine+athletes.">Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).</li><li>White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+communication:+Dietary+selenium+improves+skeletal+muscle+mitochondrial+biogenesis+in+young+equine+athletes.">Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes.</a> Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).</li><li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+FluoRespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells,+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle,+and+isolated+mitochondria.">High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li><li>Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+mitochondrial+function+in+skeletal+muscle+of+American+American+Quarter+Horses.">Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses.</a> Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).</li><li>Komlodi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mitochondrial+incubation+media+for+measurement+of+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+physiology.">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetic Communications. , (2020).</li><li>Li Puma, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+oxygen+concentration+influences+rates+of+mitochondrial+hydrogen+peroxide+release+from+cardiac+and+skeletal+muscle+preparations.">Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).</li></ol>

L’ajout de signaux fluorescents à la sortie standard du respiromètre haute résolution fournit des informations précieuses sur la physiologie mitochondriale, mais un étalonnage méticuleux du signal fluorescent est essentiel pour des données de qualité. Les protocoles originaux pour l’utilisation de MgG suggèrent que les courbes d’étalonnage générées lors du calcul des constantes de dissociation magnésium-adénylate pourraient être appliquées aux essais ultérieurs4; cependant,...

Les mitochondries des cellules eucaryotes produisent la majorité de l’ATP utilisé par les cellules pour le travail et l’entretien1. Une étape clé dans la production mitochondriale d’ATP est la conversion de l’oxygène en eau, et donc la capacité métabolique des mitochondries et des cellules associées est fréquemment quantifiée par la mesure de la consommation d’oxygène2. Cependant, la physiologie mitochondriale est plus complexe que le simple processus de consommation d’oxygène, et la dépendance à ce paramètre fournit exclusivement une évaluation incomplète de l’impact de la fonction mitochondriale et du dysfonctionnement sur la santé cellulaire. La caractérisation complète de la fonction mitochondriale nécessite l’évaluation non seulement de la consommation d’oxygène, mais aussi de la production d’ATP ainsi que des espèces réactives de l’oxygène (ROS).
Des mesures supplémentaires des fonctions mitochondriales clés peuvent être accomplies en même temps que la mesure de la respiration grâce à l’utilisation de fluorophores spécifiques. L’ester méthylique de tétraméthylrhodamine (TMRM) est un fluorophore cationique qui s’accumule dans la matrice mitochondriale proportionnellement au potentiel de tension transmembranaire mitochondriale, entraînant une diminution de l’intensité fluorescente due à cette accumulation3. TMRM peut être utilisé comme indicateur des changements relatifs dans le potentiel de la membrane mitochondriale, ou peut être utilisé pour quantifier les changements précis de la tension transmembranaire avec des expériences supplémentaires pour déterminer les constantes qui permettent la conversion du signal fluorescent en mV. Le vert de magnésium (MgG) est un fluorophore qui devient fluorescent lorsqu’il est lié à Mg2+ et est utilisé pour mesurer la synthèse de l’ATP en fonction de l’affinité différentielle de l’ADP et de l’ATP pour le cation divalentde magnésium 4. Les chercheurs doivent déterminer les constantes d’affinité/dissociation (Kd) spécifiques pour l’ADP et l’ATP dans des conditions analytiques spécifiques afin de convertir les changements de fluorescence MgG en un changement de la concentration d’ATP. Amplex UltraRed (AmR) est le fluorophore utilisé pour mesurer la production de peroxyde d’hydrogène et d’autres ROS au cours de la respiration mitochondriale5. La réaction entreH2O2et AmR (catalysée par la peroxydase de raifort) produit de la résorufine, détectable par fluorescence à 530 nM. Chacun de ces tests peut être ajouté individuellement aux tests de respiration mitochondriale en temps réel, afin de fournir des mesures simultanées des aspects respectifs de la physiologie mitochondriale, fournissant ainsi un lien direct entre la respiration et le rendement mitochondrial.
Les chevaux sont capables de taux très élevés de consommation d’oxygène spécifique à la masse, en partie à cause de la teneur mitochondriale très élevée du muscle squelettique équin, ce qui rend ce tissu très pertinent pour l’étude de la physiologie mitochondriale. Avec le développement de la respirométrie à haute résolution, les études utilisant cette nouvelle technologie ont permis de définir les contributions des mitochondries du muscle squelettique équin à la fois à la remarquable capacité d’exercice des chevaux et à la physiopathologie des maladies musculaires squelettiques 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Les études de la fonction mitochondriale du muscle squelettique équin sont particulièrement avantageuses, car l’obtention de grandes quantités de ce tissu n’est pas terminale. Ainsi, les sujets équins peuvent non seulement fournir suffisamment de tissu pour la caractérisation complète de la fonction mitochondriale, mais aussi servir de contrôles longitudinaux pour des études mécanistiques de haute qualité sur la physiologie mitochondriale. Pour cette raison, des tests supplémentaires pour quantifier le potentiel de la membrane mitochondriale, la synthèse de l’ATP et la production de ROS qui complètent la mesure de la consommation d’oxygène dans ce tissu ont été développés, afin de fournir une caractérisation plus robuste de la physiologie mitochondriale dans le muscle squelettique équin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A5285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab 7.0</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software to operate O2K fluororespirometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>516813</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M3733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial isolation kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>MITOISO1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K fluororespirometer</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium lactobionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxide dismutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration pump</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration syringes</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T5428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCH biopsy needle</td>
			<td>Millenium Surgical Corp</td>
			<td>72-238067</td>
			<td>Available in a range of sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle

La fonction mitochondriale - la phosphorylation oxydative et la génération d’espèces réactives de l’oxygène - est essentielle à la fois pour la santé et la maladie. Ainsi, la mesure de la fonction mitochondriale est fondamentale dans la recherche biomédicale. Le muscle squelettique est une source robuste de mitochondries, en particulier chez les animaux ayant une capacité aérobie très élevée, comme les chevaux, ce qui en fait des sujets idéaux pour étudier la physiologie mitochondriale. Cet article démontre l’utilisation de la respirométrie à haute résolution avec fluorométrie simultanée, avec des mitochondries musculaires squelettiques fraîchement récoltées, pour quantifier la capacité d’oxyder les substrats sous différents états mitochondriaux et déterminer les capacités relatives d’éléments distincts de la respiration mitochondriale. L’ester méthylique de tétraméthylrhodamine est utilisé pour démontrer la production du potentiel membranaire mitochondrial résultant de l’oxydation du substrat, y compris le calcul de l’efficacité relative des mitochondries en calculant le potentiel membranaire relatif généré par unité de flux d’oxygène simultané. La conversion de l’ADP en ATP entraîne une modification de la concentration de magnésium dans la chambre de réaction, en raison des différentes affinités des adénylates pour le magnésium. Par conséquent, le vert de magnésium peut être utilisé pour mesurer le taux de synthèse de l’ATP, ce qui permet de calculer davantage l’efficacité de phosphorylation oxydative (rapport de la phosphorylation à l’oxydation [P/O]). Enfin, l’utilisation d’Amplex UltraRed, qui produit un produit fluorescent (résorufine) lorsqu’il est combiné avec du peroxyde d’hydrogène, permet de quantifier la production d’espèces réactives de l’oxygène pendant la respiration mitochondriale, ainsi que la relation entre la production de ROS et la respiration concomitante. Ces techniques permettent la quantification robuste de la physiologie mitochondriale dans une variété de conditions simulées différentes, mettant ainsi en lumière la contribution de cette composante cellulaire critique à la santé et à la maladie.

L’état de référence proposé est celui d’un pur-sang sédentaire en bonne santé (pas d’amélioration de la condition physique due à l’exercice obligatoire) et d’un échantillon de muscle frais prélevé au centre d’un muscle postural, contenant un pourcentage élevé de fibres musculaires squelettiques de type I riches en mitochondries et incubé dans des conditions proches du métabolisme au repos (c.-à-d. 38 °C et pH 7,0). Dans ces conditions, l’investigateur peut s’attendre à des valeurs L N de...

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High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

Les chevaux ont une capacité d’exercice aérobique exceptionnelle, faisant du muscle squelettique équin un tissu important pour l’étude de la physiologie de l’exercice équin ainsi que de la physiologie mitochondriale des mammifères. Cet article décrit des techniques pour l’évaluation complète de la fonction mitochondriale dans le muscle squelettique équin.

Fluoro-respirométrie à haute résolution du muscle squelettique équin

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...

Ces protocoles permettent aux chercheurs d’aller au-delà de la simple mesure de la consommation d’oxygène mitochondrial, et permettent plutôt la mesure des produits finaux mitochondriaux clés, de l’ATP et des espèces réactives de l’oxygène. Le principal avantage de cette technique est que l’investigateur peut mesurer l’efficacité mitochondriale en comparant directement le taux de consommation d’oxygène au taux de production du produit final. Si le produit final est l’ATP ou l’oxygène réactif.Les techniques nécessitent une attention particulière aux détails, en particulier pour éviter les bulles. Qu’elles soient dans la chambre respiratoire ou dans les seringues de titrage, les bulles sont votre ennemi car elles rendent les mesures moins précises. Après avoir obtenu les biopsies des muscles squelettiques.Remplissez les chambres du respiromètre avec un média sans magnésium et scellez la chambre d’incubation. Réglez la température d’incubation de l’instrument à 38 degrés Celsius pour représenter la température basale du muscle squelettique équin. Et réglez le mélange du milieu respiratoire à 750 tr/min en utilisant une agitation magnétique tournant dans le fond de la chambre du respiromètre.Ensuite, éteignez l’éclairage de la chambre pour éviter les interférences avec les capteurs fluorescents. Mettez l’électrode d’oxygène sous tension de polarisation de 800 millivolts et amplifiez le signal résultant avec un réglage de gain de un. Enregistrer la concentration d’oxygène toutes les deux secondes et calculer le flux d’oxygène comme la pente négative de la mesure de l’oxygène sur les 40 secondes suivantes.Ensuite, calibrez le capteur d’oxygène en permettant au média de s’équilibrer avec l’air ambiant. Calculer la pression partielle d’oxygène de référence en fonction de la pression barométrique mesurée par le respiromètre à haute résolution et de la concentration atmosphérique standard d’oxygène. Utilisez des capteurs fluorescents verts pour quantifier le signal fluorescent de la chambre respiratoire.Mettez les capteurs sous tension de 400 à 500 millivolts et le signal résultant est amplifié avec un gain de 1 à 1 000. Ensuite, ajoutez TMRM à la chambre respiratoire avant d’ajouter des mitochondries et calibrez le signal fluorescent en utilisant un simple étalonnage en deux points du signal fluorescent par rapport à la quantité de fluorophore ajoutée avant l’ajout des mitochondries. Effectuer l’étalonnage final du signal TMRM après l’achèvement du protocole de titrage de la respirométrie en délivrant plusieurs titrages de l’agent de découplage jusqu’à ce qu’aucune autre augmentation du signal fluorescent TMRM ne soit observée, indiquant l’effondrement complet du potentiel de membrane mitochondriale.Utilisez des capteurs fluorescents bleus pour quantifier le signal fluorescent de la chambre respiratoire et mettez ces capteurs sous tension pour que les instruments individuels capturent le signal attendu dans la plage linéaire du capteur. Ajoutez huit microlitres d’EDTA à deux millimolaires dans la chambre respiratoire pour chélater les cations qui entreraient en compétition avec les ions magnésium pour se lier au vert de magnésium. Ensuite, ajoutez quatre microlitres d’un millimolaire vert de magnésium à la chambre respiratoire.Calibrer le signal fluorescent brut avec des titrages séquentiels de 100 millimolaires de chlorure de magnésium de 100 millilitres, en permettant une minute entre les titrages pour stabiliser le signal fluorescent. Déterminer le taux de synthèse de l’ATTP qui est la pente de la concentration d’ATP au fil du temps tout au long du protocole. Utilisez des capteurs fluorescents verts pour quantifier le signal fluorescent de la chambre respiratoire.Mettez les capteurs sous tension de 300 à 400 millivolts. Et le signal résultant est amplifié avec un gain de 1 à 1 000. Optimisez les paramètres spécifiques pour les instruments individuels afin de capturer le signal attendu dans la plage linéaire du capteur.Avant d’ajouter les mitochondries, effectuez la configuration chimique et l’étalonnage initial du test Amplex UltraRed. Ajouter 30 micromoles de DTPA aux cations chélatés qui pourraient interférer avec la réaction. Ajoutez ensuite la superoxyde dismutase ou la serratus peroxydase et Amplex UltraRed dans la chambre de respirométrie.Laissez le signal fluorescent se stabiliser. Ajoutez ensuite 0,2 micromole de peroxyde d’hydrogène deux fois avec un intervalle de cinq minutes. Effectuer des étalonnages supplémentaires en deux points tout au long de l’essai pour permettre l’ajustement de la réactivité de l’essai à mesure que la chimie de la respirométrie change tout au long de l’essai avec le moment précis de ces points d’étalonnage à la discrétion de l’investigateur.Vortex l’échantillon pour maintenir une suspension d’échantillon uniforme et ajouter 15 microlitres de suspension mitochondriale isolée à chaque chambre d’incubation de deux millilitres afin que les résultats représentent le rendement mitochondrial de 18,75 milligrammes de muscle. Avant d’ajouter des substrats, mesurez la consommation d’oxygène résiduel et soustrayez cette valeur des valeurs de consommation d’oxygène de chaque étape du titrage inhibiteur non couplé du substrat ou du protocole SUIT après l’achèvement. Utilisez un SUIT à usage général qui permet la caractérisation initiale de la fonction mitochondriale du muscle squelettique équin.Commencez par des titrages séquentiels de pyruvate, de glutamate et de malate l’un dans l’autre dans chaque chambre pour produire du nicotinamide adénine dinucléotide et stimuler la respiration non phosphorylante soutenue par le NADH oxydé par une fuite complexe à base unique. Ensuite, ajoutez de l’ADP pour stimuler la respiration phosphorylante par une respiration phosphorylante complexe. Ajouter du succinate pour produire une respiration phosphorylante en combinant la respiration phosphorylante complexe un et complexe deux Ajoutez de la roténone pour bloquer le complexe.Le flux d’oxygène résultant représente la capacité du complexe deux à soutenir la consommation d’oxygène mitochondrial par l’oxydation du succinate seul. Une trace de pneumométrie à haute résolution de la respiration mitochondriale du muscle squelettique équin et du potentiel membranaire relatif est montrée. Les valeurs respiratoires des mitochondries incubées avec TMRM sont plus faibles en raison d’un effet inhibiteur de ce fluorophore.La respiration mitochondriale et la synthèse ATTP du muscle squelettique équin contenant un pourcentage élevé de fibres musculaires squelettiques de type un riches en mitochondries et incubées dans des conditions proches du métabolisme au repos sont montrées. Une trace de pneumométrie de la respiration mitochondriale du muscle squelettique équin et de la production de peroxyde d’hydrogène est montrée. La respirométrie haute résolution demande beaucoup de patience.La personne qui exécute le test aura de nombreux moments où elle devra porter un jugement quant à savoir si un état stable a été atteint et si la prochaine étape peut se produire. Nous n’avons démontré qu’un seul protocole de titrage. Il existe des dizaines d’autres protocoles qui peuvent être appliqués de la même manière pour répondre à des questions spécifiques concernant le métabolisme mitochondrial.

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Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adultes et embryonnaires Culture squelettique Microexplant musculaire et isolement de cellules souches du muscle squelettique

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

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Biologie

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Isolement mitochondriale du muscle squelettique

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Purification des progéniteurs du muscle squelettique

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procédures pour Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriétés contractiles musculaires squelettiques

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Évaluation ex vivo de la contractilité, fatigabilité et isolées du Alternans muscles squelettiques

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-infligé des blessures de poisson zèbre muscle squelettique embryonnaire

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Évaluation de calcium Sparks dans intactes les fibres musculaires squelettiques

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolement des mitochondries Intact du muscle squelettique par centrifugation différentielle pour respirométriques mesures haute résolution

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolement et caractérisation d’exosomes à partir de fibroblastes musculaires squelettiques

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Construction d’un modèle squelettique équin réaliste, en trois dimensions, à l’aide de données de tomodensitométrie

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...