Name: high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle
Uploaded: 2023-02-03T14:40:00
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Die Autoren bedanken sich für die großzügige Unterstützung des John and Debbie Oxley Stiftungslehrstuhls für Pferdesportmedizin und der Grayson Jockey Club Research Foundation.

Diese Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Oklahoma State University genehmigt. Vier Vollblutwallache (17,5 ± 1,3 Jahre, 593 ± 45 kg) wurden in dieser Studie verwendet, um die repräsentativen Ergebnisse zu generieren.
1. Entnahme einer Skelettmuskelbiopsie
<ol><li>Entnahme von Skelettmuskelbiopsien (sterile Technik) aus der Mitte des Semitendinosusmuskels (oder eines anderen Muskels von Interesse) unter Verwendung einer 12-G-Biopsienadel des Un...

<ol>
	<li>Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+muscle+approaching+maximal+rates+of+oxygen+utilization.">Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization.</a> Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , (2014).</li><li>Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+can+be+determined+in+individual+cells+from+the+nernstian+distribution+of+cationic+dyes.">Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes.</a> Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).</li><li>Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ADP-ATP+exchange+in+relation+to+mitochondrial+transmembrane+potential+and+oxygen+consumption.">Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).</li><li>Krumschnabel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).</li><li>Lemieux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+is+altered+in+horse+atypical+myopathy.">Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy.</a> Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).</li><li>Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+muscle+mitochondrial+respiratory+capacity+in+Standardbred+racehorses+as+an+aid+to+predicting+exertional+rhabdomyolysis.">Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis.</a> Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).</li><li>Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+fitness+and+mitochondrial+respiratory+capacity+in+horse+skeletal+muscle.">Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).</li><li>Votion, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+mitochondrial+respiratory+function+in+response+to+endurance+training+and+endurance+racing.">Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing.</a> Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).</li><li>Tosi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+capacity+in+horses+suffering+from+polysaccharide+storage+myopathy.">Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).</li><li>Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hyperthermia+and+acidosis+on+equine+skeletal+muscle+mitochondrial+oxygen+consumption.">Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption.</a> Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).</li><li>Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAPID+COMMUNICATION:+Differential+skeletal+muscle+mitochondrial+characteristics+of+weanling+racing-bred+horses1.">RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1.</a> Journal of Animal Science. , (2019).</li><li>White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submaximal+exercise+training+improves+mitochondrial+efficiency+in+the+gluteus+medius+but+not+in+the+triceps+brachii+of+young+equine+athletes.">Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).</li><li>White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+communication:+Dietary+selenium+improves+skeletal+muscle+mitochondrial+biogenesis+in+young+equine+athletes.">Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes.</a> Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).</li><li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+FluoRespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells,+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle,+and+isolated+mitochondria.">High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li><li>Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+mitochondrial+function+in+skeletal+muscle+of+American+American+Quarter+Horses.">Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses.</a> Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).</li><li>Komlodi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mitochondrial+incubation+media+for+measurement+of+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+physiology.">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetic Communications. , (2020).</li><li>Li Puma, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+oxygen+concentration+influences+rates+of+mitochondrial+hydrogen+peroxide+release+from+cardiac+and+skeletal+muscle+preparations.">Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).</li></ol>

Die Hinzufügung von Fluoreszenzsignalen zum Standardausgang des hochauflösenden Respirometers liefert wertvolle Informationen über die mitochondriale Physiologie, aber eine sorgfältige Kalibrierung des Fluoreszenzsignals ist entscheidend für die Qualität der Daten. Die ursprünglichen Protokolle für die Verwendung von MgG deuten darauf hin, dass die Kalibrierkurven, die bei der Berechnung der Magnesium-Adenylat-Dissoziationskonstanten erzeugt wurden, auf nachfolgende Assays angewendet werden könnten<sup class="xr...

Die Mitochondrien eukaryotischer Zellen produzieren den Großteil des ATP, das von den Zellen für Arbeit und Wartung verwendet wird1. Ein wichtiger Schritt in der mitochondrialen Produktion von ATP ist die Umwandlung von Sauerstoff in Wasser, und daher wird die Stoffwechselkapazität der Mitochondrien und der zugehörigen Zellen häufig durch die Messung des Sauerstoffverbrauchs quantifiziert2. Die mitochondriale Physiologie ist jedoch komplexer als der einfache Prozess des Sauerstoffverbrauchs, und die ausschließliche Abhängigkeit von diesem Endpunkt ermöglicht eine unvollständige Bewertung der Auswirkungen der mitochondrialen Funktion und Dysfunktion auf die Zellgesundheit. Die vollständige Charakterisierung der mitochondrialen Funktion erfordert nicht nur die Beurteilung des Sauerstoffverbrauchs, sondern auch der Produktion von ATP sowie reaktiven Sauerstoffspezies (ROS).
Zusätzliche Messungen wichtiger mitochondrialer Funktionen können gleichzeitig mit der Messung der Atmung durch den Einsatz spezifischer Fluorophore durchgeführt werden. Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM) ist ein kationischer Fluorophor, der sich in der mitochondrialen Matrix proportional zum mitochondrialen Transmembranspannungspotential anreichert, was aufgrund dieser Akkumulation zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität führt3. TMRM kann als Indikator für relative Änderungen des mitochondrialen Membranpotentials verwendet werden, oder kann verwendet werden, um präzise Änderungen der Transmembranspannung mit zusätzlichen Experimenten zu quantifizieren, um Konstanten zu bestimmen, die eine Umwandlung des Fluoreszenzsignals in mV ermöglichen. Magnesiumgrün (MgG) ist ein Fluorophor, der fluoresziert, wenn er an Mg2+ gebunden ist, und wird für Messungen der ATP-Synthese verwendet, die auf der differentiellen Affinität von ADP und ATP für das zweiwertige Magnesiumkation4 basieren. Die Forscher müssen die spezifischen Affinitäts-/Dissoziationskonstanten (Kd) sowohl für ADP als auch für ATP unter bestimmten analytischen Bedingungen bestimmen, um die Änderungen der MgG-Fluoreszenz in eine Änderung der ATP-Konzentration umzuwandeln. Amplex UltraRed (AmR) ist der Fluorophor, der zur Messung der Produktion von Wasserstoffperoxid und anderen ROS während der mitochondrialen Atmung verwendet wird5. Durch die Reaktion zwischenH2O2und AmR (das durch Meerrettichperoxidase katalysiert wird) entsteht Resorufin, das durch Fluoreszenz bei 530 nM nachweisbar ist. Jeder dieser Assays kann einzeln zu Assays der mitochondrialen Atmung in Echtzeit hinzugefügt werden, um gleichzeitige Messungen der jeweiligen Aspekte der mitochondrialen Physiologie zu ermöglichen und so eine direkte Verbindung zwischen Atmung und mitochondrialem Output herzustellen.
Pferde sind in der Lage, einen sehr hohen massespezifischen Sauerstoffverbrauch zu erzielen, was zum Teil auf den sehr hohen mitochondrialen Gehalt der Skelettmuskulatur von Pferden zurückzuführen ist, was dieses Gewebe für die Untersuchung der mitochondrialen Physiologie von großer Bedeutung macht. Mit der Entwicklung der hochauflösenden Respirometrie haben Studien mit dieser neuartigen Technologie dazu beigetragen, den Beitrag der Mitochondrien der Skelettmuskulatur von Pferden sowohl zur bemerkenswerten körperlichen Leistungsfähigkeit von Pferden als auch zur Pathophysiologie von Skelettmuskelerkrankungen zu definieren 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Untersuchungen der mitochondrialen Funktion der Skelettmuskulatur von Pferden sind besonders vorteilhaft, da die Gewinnung großer Mengen dieses Gewebes nicht terminal ist. So können Pferde nicht nur ausreichend Gewebe für die vollständige Charakterisierung der mitochondrialen Funktion bereitstellen, sondern auch als Längsschnittkontrollen für qualitativ hochwertige, mechanistische Studien zur mitochondrialen Physiologie dienen. Aus diesem Grund wurden zusätzliche Assays zur Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials, der ATP-Synthese und der Produktion von ROS entwickelt, die die Messung des Sauerstoffverbrauchs in diesem Gewebe ergänzen, um eine robustere Charakterisierung der mitochondrialen Physiologie in der Skelettmuskulatur von Pferden zu ermöglichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A5285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab 7.0</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software to operate O2K fluororespirometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>516813</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M3733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial isolation kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>MITOISO1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K fluororespirometer</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium lactobionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxide dismutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration pump</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration syringes</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T5428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCH biopsy needle</td>
			<td>Millenium Surgical Corp</td>
			<td>72-238067</td>
			<td>Available in a range of sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle

Die Funktion der Mitochondrien - oxidative Phosphorylierung und die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies - ist sowohl für die Gesundheit als auch für die Krankheit von entscheidender Bedeutung. Daher ist die Messung der mitochondrialen Funktion von grundlegender Bedeutung für die biomedizinische Forschung. Die Skelettmuskulatur ist eine robuste Quelle für Mitochondrien, insbesondere bei Tieren mit einer sehr hohen aeroben Kapazität, wie z. B. Pferden, was sie zu idealen Objekten für die Untersuchung der mitochondrialen Physiologie macht. Dieser Artikel demonstriert die Verwendung von hochauflösender Respirometrie mit gleichzeitiger Fluorometrie mit frisch entnommenen Mitochondrien der Skelettmuskulatur, um die Fähigkeit zur Oxidation von Substraten in verschiedenen mitochondrialen Zuständen zu quantifizieren und die relativen Kapazitäten verschiedener Elemente der mitochondrialen Atmung zu bestimmen. Tetramethylrhodaminmethylester wird verwendet, um die Produktion des mitochondrialen Membranpotentials zu demonstrieren, das sich aus der Substratoxidation ergibt, einschließlich der Berechnung der relativen Effizienz der Mitochondrien durch Berechnung des relativen Membranpotentials, das pro Einheit des gleichzeitigen Sauerstoffflusses erzeugt wird. Die Umwandlung von ADP in ATP führt zu einer Änderung der Magnesiumkonzentration in der Reaktionskammer, die auf unterschiedliche Affinitäten der Adenylate zu Magnesium zurückzuführen ist. Daher kann Magnesiumgrün verwendet werden, um die Rate der ATP-Synthese zu messen, was eine weitere Berechnung der oxidativen Phosphorylierungseffizienz (Verhältnis von Phosphorylierung zu Oxidation [P/O]) ermöglicht. Schließlich ermöglicht die Verwendung von Amplex UltraRed, das in Kombination mit Wasserstoffperoxid ein fluoreszierendes Produkt (Resorufin) erzeugt, die Quantifizierung der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies während der mitochondrialen Atmung sowie die Beziehung zwischen ROS-Produktion und gleichzeitiger Atmung. Diese Techniken ermöglichen die robuste Quantifizierung der mitochondrialen Physiologie unter einer Vielzahl unterschiedlicher simulierter Bedingungen und geben so Aufschluss über den Beitrag dieser kritischen zellulären Komponente zu Gesundheit und Krankheit.

Der vorgeschlagene Referenzzustand ist der eines gesunden, sesshaften Vollbluts (keine erhöhte Fitness durch Zwangsbewegung) und einer frischen Muskelprobe, die aus dem Zentrum eines Haltungsmuskels entnommen wurde, einen hohen Anteil an mitochondrienreichen Typ-I-Skelettmuskelfasern enthält und unter Bedingungen inkubiert wurde, die dem Ruhestoffwechsel nahe kommen (d. h. 38 °C und pH 7,0). Unter diesen Bedingungen kann der Untersucher mit L-N-Werten von 2,71 ± 0,90,P-N-Werten von 62,40 ± 26,22, P-N+S-We...

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High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

Pferde verfügen über eine außergewöhnliche aerobe Trainingskapazität, was die Skelettmuskulatur von Pferden zu einem wichtigen Gewebe sowohl für die Untersuchung der Trainingsphysiologie von Pferden als auch für die mitochondriale Physiologie von Säugetieren macht. Dieser Artikel beschreibt Techniken zur umfassenden Beurteilung der mitochondrialen Funktion in der Skelettmuskulatur von Pferden.

Hochauflösende Fluoro-Respirometrie der Skelettmuskulatur von Pferden

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...

Diese Protokolle ermöglichen es den Forschern, über die bloße Messung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs hinauszugehen und stattdessen die Messung wichtiger mitochondrialer Endprodukte, ATP und reaktiver Sauerstoffspezies, zu ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der Forscher die mitochondriale Effizienz messen kann, indem er die Rate des Sauerstoffverbrauchs direkt mit der Rate der Endproduktproduktion vergleicht. Unabhängig davon, ob es sich bei dem Endprodukt um ATP oder reaktiven Sauerstoff handelt.Die Techniken erfordern eine sehr sorgfältige Liebe zum Detail, insbesondere bei der Vermeidung von Blasen. Egal, ob sie sich in der Beatmungskammer oder in Titrationsspritzen befinden, Blasen sind Ihr Feind, da sie die Messungen weniger genau machen. Nach der Entnahme der Skelettmuskelbiopsien.Füllen Sie die Respirometerkammern mit magnesiumfreien Medien und verschließen Sie die Inkubationskammer. Stellen Sie die Inkubationstemperatur des Instruments auf 38 Grad Celsius ein, um die Basaltemperatur der Skelettmuskulatur des Pferdes darzustellen. Stellen Sie das Mischen des Beatmungsmediums auf 750 U/min ein, indem Sie einen magnetischen Rührer am Boden der Respirometerkammer drehen.Schalten Sie als Nächstes die Kammerbeleuchtung aus, um Interferenzen mit Leuchtstoffsensoren zu vermeiden. Versorgen Sie die Sauerstoffelektrode mit einer Polarisationsspannung von 800 Millivolt und verstärken Sie das resultierende Signal mit einer Verstärkungseinstellung von eins. Zeichnen Sie die Sauerstoffkonzentration alle zwei Sekunden auf und berechnen Sie den Sauerstofffluss als negative Steigung der Sauerstoffmessung über die folgenden 40 Sekunden.Kalibrieren Sie dann den Sauerstoffsensor, indem Sie das Medium mit der Raumluft ausgleichen lassen. Berechnen Sie den Referenzsauerstoffpartialdruck basierend auf dem mit dem hochauflösenden Respirometer gemessenen Luftdruck und der Standard-Luftsauerstoffkonzentration. Verwenden Sie grüne Fluoreszenzsensoren, um das Fluoreszenzsignal aus der Beatmungskammer zu quantifizieren.Schaltet man die Sensoren mit 400 bis 500 Millivolt ein, wird das resultierende Signal mit einer Verstärkung von 1 bis 1.000 verstärkt. Als nächstes fügen Sie TMRM in die Beatmungskammer hinzu, bevor Sie Mitochondrien hinzufügen, und kalibrieren Sie das Fluoreszenzsignal mit einer einfachen Zwei-Punkt-Kalibrierung des Fluoreszenzsignals im Vergleich zur Menge des hinzugefügten Fluorophors vor der Zugabe der Mitochondrien. Führen Sie die endgültige Kalibrierung des TMRM-Signals nach Abschluss des Respirometrie-Titrationsprotokolls durch, indem Sie mehrere Titrationen des Entkopplungsmittels durchführen, bis keine weiteren Anstiege des TMRM-Fluoreszenzsignals beobachtet werden, was auf einen vollständigen Kollaps des mitochondrialen Membranpotentials hinweist.Verwenden Sie blaue Fluoreszenzsensoren, um das Fluoreszenzsignal aus der Beatmungskammer zu quantifizieren, und aktivieren Sie diese Sensoren für einzelne Instrumente, um das erwartete Signal innerhalb des linearen Bereichs des Sensors zu erfassen. Geben Sie acht Mikroliter zweimillimolares EDTA in die Atemkammer, um Kationen zu chelatisieren, die mit Magnesiumionen um die Bindung an Magnesiumgrün konkurrieren würden. Geben Sie dann vier Mikroliter eines millimolaren Magnesiumgrüns in die Beatmungskammer.Kalibrieren Sie das rohe Fluoreszenzsignal mit 10 x 2 Mikrolitern sequenziellen Titrationen von 100 millimolarem Magnesiumchlorid, wobei zwischen den Titrationen eine Minute zur Stabilisierung des Fluoreszenzsignals eingeplant wird. Bestimmen Sie die ATTP-Syntheserate, d. h. die Steigung der ATP-Konzentration im Laufe der Zeit im gesamten Protokoll. Verwenden Sie grüne Fluoreszenzsensoren, um das Fluoreszenzsignal aus der Beatmungskammer zu quantifizieren.Versorgen Sie die Sensoren mit 300 bis 400 Millivolt. Und das resultierende Signal wird mit einer Verstärkung von 1 bis 1.000 verstärkt. Optimieren Sie spezifische Einstellungen für einzelne Instrumente, um das erwartete Signal innerhalb des linearen Bereichs des Sensors zu erfassen.Bevor Sie die Mitochondrien hinzufügen, führen Sie den chemischen Aufbau und die Erstkalibrierung des Amplex UltraRed Assays durch. Fügen Sie 30 Mikromol DTPA hinzu, um Kationen zu chelatisieren, die die Reaktion stören könnten. Geben Sie dann Superoxiddismutase oder Serratusperoxidase und Amplex UltraRed in die Respirometriekammer.Lassen Sie das Fluoreszenzsignal stabilisieren. Fügen Sie dann zweimal 0,2 Mikromol Wasserstoffperoxid im Abstand von fünf Minuten hinzu. Führen Sie zusätzliche Zwei-Punkt-Kalibrierungen während des gesamten Assays durch, um die Reaktionsfähigkeit des Assays anpassen zu können, da sich die Chemie der Respirometrie während des Assays mit dem spezifischen Timing dieser Kalibrierungspunkte nach Ermessen des Prüfers ändert.Wirbeln Sie die Probe vor, um eine gleichmäßige Probensuspension aufrechtzuerhalten, und fügen Sie 15 Mikroliter isolierte Mitochondriensuspension in jede Zwei-Milliliter-Inkubationskammer hinzu, so dass die Ergebnisse die mitochondriale Ausbeute von 18,75 Milligramm Muskel darstellen. Messen Sie vor der Zugabe von Substraten den Restsauerstoffverbrauch und subtrahieren Sie diesen Wert nach Abschluss von den Sauerstoffverbrauchswerten jedes Schritts in der Titration des substratentkoppelten Inhibitors oder des SUIT-Protokolls. Verwenden Sie einen Allzweck-SUIT, der die anfängliche Charakterisierung der mitochondrialen Funktion der Skelettmuskulatur von Pferden ermöglicht.Beginnen Sie mit sequenziellen Titrationen von Pyruvat, Glutamat und Malat ineinander in jede Kammer, um Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid zu produzieren und die nichtphosphorylierende Atmung zu stimulieren, die durch NADH unterstützt wird, das durch komplexes einsbasiertes Leck oxidiert wird. Fügen Sie dann ADP hinzu, um die phosphorylierende Atmung durch eine phosphorylierende Atmung zu stimulieren. Fügen Sie Succinat hinzu, um eine phosphorylierende Atmung zu erzeugen, indem Sie Komplex eins und Komplex zwei phosphorylierende Atmung kombinieren Fügen Sie Rotenon hinzu, um Komplex eins zu blockieren.Der resultierende Sauerstofffluss stellt die Fähigkeit des zweiten Komplexes dar, den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch allein durch die Oxidation von Succinat zu unterstützen. Eine hochauflösende Respirometriespur der mitochondrialen Atmung der Skelettmuskulatur des Pferdes und des relativen Membranpotentials wird gezeigt. Die Atmungswerte von Mitochondrien, die mit TMRM inkubiert wurden, sind aufgrund einer hemmenden Wirkung dieses Fluorophors niedriger.Die mitochondriale Atmung und die ATTP-Synthese von Skelettmuskeln von Pferden, die einen hohen Anteil an mitochondrienreichen Typ-1-Skelettmuskelfasern enthalten und unter Bedingungen inkubiert werden, die dem Ruhestoffwechsel nahe kommen, werden gezeigt. Die Respirometrie, die Spur der mitochondrialen Atmung der Skelettmuskulatur des Pferdes und die Produktion von Wasserstoffperoxid wird gezeigt. Hochauflösende Respirometrie erfordert viel Geduld.Die Person, die den Assay durchführt, hat zahlreiche Zeitpunkte, an denen sie eine Entscheidung darüber treffen muss, ob ein stationärer Zustand erreicht wurde und der nächste Schritt erfolgen kann. Wir haben nur ein einziges Titrationsprotokoll demonstriert. Es gibt Dutzende weiterer Protokolle, die auf die gleiche Weise angewendet werden können, um spezifische Fragen zum mitochondrialen Stoffwechsel zu beantworten.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Forschung

Biologie

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Verfahren für die Ratte<em&gt; In situ</em&gt; Skeletal Muscle kontraktilen Eigenschaften

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Beurteilung der Kontraktilität, Müdigkeit und Alternans in isolierten Skelettmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-Schädigung der Zebrafisch Embryonale Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Skelettmuskelfibroblasten

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Konstruktion eines realistischen, dreidimensionalen Ganzkörper-Pferdeskelettmodells unter Verwendung von Computertomographiedaten

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...