Name: high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle
Uploaded: 2023-02-03T14:40:00
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Gli autori desiderano riconoscere il generoso sostegno della John and Debbie Oxley Endowed Chair for Equine Sports Medicine e della Grayson Jockey Club Research Foundation.

Questo studio è stato approvato dall'Oklahoma State University Institutional Animal Care and Use Committee. Quattro castoni purosangue (17,5 ± 1,3 anni, 593 ± 45 kg) sono stati utilizzati in questo studio per generare i risultati rappresentativi.
1. Ottenere un campione di biopsia del muscolo scheletrico
<ol><li>Ottenere biopsie muscolari scheletriche (seguire la tecnica sterile) dal centro del muscolo semitendinoso (o altro muscolo di interesse), utilizzando un ago da bi...

<ol>
	<li>Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+muscle+approaching+maximal+rates+of+oxygen+utilization.">Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization.</a> Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , (2014).</li><li>Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+can+be+determined+in+individual+cells+from+the+nernstian+distribution+of+cationic+dyes.">Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes.</a> Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).</li><li>Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ADP-ATP+exchange+in+relation+to+mitochondrial+transmembrane+potential+and+oxygen+consumption.">Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).</li><li>Krumschnabel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).</li><li>Lemieux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+is+altered+in+horse+atypical+myopathy.">Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy.</a> Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).</li><li>Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+muscle+mitochondrial+respiratory+capacity+in+Standardbred+racehorses+as+an+aid+to+predicting+exertional+rhabdomyolysis.">Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis.</a> Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).</li><li>Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+fitness+and+mitochondrial+respiratory+capacity+in+horse+skeletal+muscle.">Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).</li><li>Votion, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+mitochondrial+respiratory+function+in+response+to+endurance+training+and+endurance+racing.">Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing.</a> Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).</li><li>Tosi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+capacity+in+horses+suffering+from+polysaccharide+storage+myopathy.">Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).</li><li>Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hyperthermia+and+acidosis+on+equine+skeletal+muscle+mitochondrial+oxygen+consumption.">Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption.</a> Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).</li><li>Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAPID+COMMUNICATION:+Differential+skeletal+muscle+mitochondrial+characteristics+of+weanling+racing-bred+horses1.">RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1.</a> Journal of Animal Science. , (2019).</li><li>White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submaximal+exercise+training+improves+mitochondrial+efficiency+in+the+gluteus+medius+but+not+in+the+triceps+brachii+of+young+equine+athletes.">Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).</li><li>White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+communication:+Dietary+selenium+improves+skeletal+muscle+mitochondrial+biogenesis+in+young+equine+athletes.">Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes.</a> Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).</li><li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+FluoRespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells,+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle,+and+isolated+mitochondria.">High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li><li>Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+mitochondrial+function+in+skeletal+muscle+of+American+American+Quarter+Horses.">Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses.</a> Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).</li><li>Komlodi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mitochondrial+incubation+media+for+measurement+of+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+physiology.">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetic Communications. , (2020).</li><li>Li Puma, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+oxygen+concentration+influences+rates+of+mitochondrial+hydrogen+peroxide+release+from+cardiac+and+skeletal+muscle+preparations.">Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).</li></ol>

L'aggiunta di segnali fluorescenti all'uscita standard del respirometro ad alta risoluzione fornisce preziose informazioni sulla fisiologia mitocondriale, ma una calibrazione meticolosa del segnale fluorescente è fondamentale per i dati di qualità. I protocolli originali per l'uso di MgG suggeriscono che le curve di calibrazione generate durante il calcolo delle costanti di dissociazione magnesio-adenilato potrebbero essere applicate ai saggi successivi4; tuttavia, il segnale fluorescente proven...

I mitocondri delle cellule eucariotiche producono la maggior parte dell'ATP utilizzato dalle cellule per il lavoro e il mantenimento1. Un passo chiave nella produzione mitocondriale di ATP è la conversione dell'ossigeno in acqua, e quindi la capacità metabolica dei mitocondri e delle cellule associate è spesso quantificata attraverso la misurazione del consumo di ossigeno2. Tuttavia, la fisiologia mitocondriale è più complessa del semplice processo di consumo di ossigeno e la dipendenza da questo endpoint fornisce esclusivamente una valutazione incompleta dell'impatto della funzione e della disfunzione mitocondriale sulla salute cellulare. La caratterizzazione completa della funzione mitocondriale richiede la valutazione non solo del consumo di ossigeno, ma anche della produzione di ATP e delle specie reattive dell'ossigeno (ROS).
Ulteriori misure delle funzioni mitocondriali chiave possono essere eseguite in concomitanza con la misurazione della respirazione attraverso l'uso di fluorofori specifici. Il tetrametilrodamina metilestere (TMRM) è un fluoroforo cationico che si accumula nella matrice mitocondriale in proporzione al potenziale di tensione transmembrana mitocondriale, con conseguente diminuzione dell'intensità fluorescente dovuta a questo accumulo3. La TMRM può essere utilizzata come indicatore dei cambiamenti relativi nel potenziale di membrana mitocondriale o può essere utilizzata per quantificare cambiamenti precisi nella tensione transmembrana con ulteriori esperimenti per determinare costanti che consentano la conversione del segnale fluorescente in mV. Il verde di magnesio (MgG) è un fluoroforo che fluoresce quando si lega con Mg2+ e viene utilizzato per misurazioni della sintesi di ATP basate sull'affinità differenziale di ADP e ATP per il catione bivalente di magnesio4. I ricercatori devono determinare le costanti di affinità/dissociazione specifiche (Kd) sia per ADP che per ATP in specifiche condizioni analitiche per convertire le variazioni della fluorescenza di MgG in una variazione della concentrazione di ATP. Amplex UltraRed (AmR) è il fluoroforo utilizzato per misurare la produzione di perossido di idrogeno e altri ROS durante la respirazione mitocondriale5. La reazione tra H2 O2 e AmR (che è catalizzata dalla perossidasi di rafano) produce resorufina, che è rilevabile attraverso la fluorescenza a 530 nM. Ciascuno di questi test può essere aggiunto individualmente ai saggi di respirazione mitocondriale in tempo reale, per fornire misurazioni simultanee dei rispettivi aspetti della fisiologia mitocondriale, fornendo così un collegamento diretto tra respirazione e output mitocondriale.
I cavalli sono capaci di tassi molto elevati di consumo di ossigeno specifico per massa, dovuto in parte all'altissimo contenuto mitocondriale del muscolo scheletrico equino, rendendo questo tessuto altamente rilevante per lo studio della fisiologia mitocondriale. Con lo sviluppo della respirometria ad alta risoluzione, gli studi che utilizzano questa nuova tecnologia hanno contribuito a definire i contributi dei mitocondri del muscolo scheletrico equino sia alla notevole capacità di esercizio dei cavalli che alla fisiopatologia delle malattie del muscolo scheletrico 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Gli studi sulla funzione mitocondriale del muscolo scheletrico equino sono particolarmente vantaggiosi, in quanto l'ottenimento di grandi quantità di questo tessuto non è terminale. Pertanto, i soggetti equini possono non solo fornire tessuto sufficiente per la caratterizzazione completa della funzione mitocondriale, ma anche servire come controlli longitudinali per studi meccanicistici di alta qualità sulla fisiologia mitocondriale. Per questo motivo, sono stati sviluppati ulteriori saggi per quantificare il potenziale di membrana mitocondriale, la sintesi di ATP e la produzione di ROS che completano la misurazione del consumo di ossigeno in questo tessuto, al fine di fornire una caratterizzazione più robusta della fisiologia mitocondriale nel muscolo scheletrico equino.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A5285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab 7.0</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software to operate O2K fluororespirometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>516813</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M3733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial isolation kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>MITOISO1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K fluororespirometer</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium lactobionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxide dismutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration pump</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration syringes</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T5428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCH biopsy needle</td>
			<td>Millenium Surgical Corp</td>
			<td>72-238067</td>
			<td>Available in a range of sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle

La funzione mitocondriale - fosforilazione ossidativa e generazione di specie reattive dell'ossigeno - è fondamentale sia per la salute che per la malattia. Pertanto, misurare la funzione mitocondriale è fondamentale nella ricerca biomedica. Il muscolo scheletrico è una robusta fonte di mitocondri, in particolare negli animali con una capacità aerobica molto elevata, come i cavalli, rendendoli soggetti ideali per lo studio della fisiologia mitocondriale. Questo articolo dimostra l'uso della respirometria ad alta risoluzione con fluorometria concomitante, con mitocondri muscolari scheletrici appena raccolti, per quantificare la capacità di ossidare i substrati in diversi stati mitocondriali e determinare le capacità relative di elementi distinti della respirazione mitocondriale. L'estere metilestrale tetrametilrodamina viene utilizzato per dimostrare la produzione di potenziale di membrana mitocondriale derivante dall'ossidazione del substrato, compreso il calcolo dell'efficienza relativa dei mitocondri calcolando il potenziale di membrana relativo generato per unità di flusso concomitante di ossigeno. La conversione di ADP in ATP provoca un cambiamento nella concentrazione di magnesio nella camera di reazione, a causa delle diverse affinità degli adenilati per il magnesio. Pertanto, il verde magnesio può essere utilizzato per misurare la velocità di sintesi dell'ATP, consentendo l'ulteriore calcolo dell'efficienza di fosforilazione ossidativa (rapporto tra fosforilazione e ossidazione [P/O]). Infine, l'uso di Amplex UltraRed, che produce un prodotto fluorescente (resorufin) quando combinato con perossido di idrogeno, consente la quantificazione della produzione di specie reattive dell'ossigeno durante la respirazione mitocondriale, nonché la relazione tra produzione di ROS e respirazione concomitante. Queste tecniche consentono la robusta quantificazione della fisiologia mitocondriale in una varietà di diverse condizioni simulate, facendo così luce sul contributo di questa componente cellulare critica sia alla salute che alla malattia.

Lo stato di riferimento proposto è quello di un purosangue sedentario sano (nessun aumento della forma fisica dovuto all'esercizio fisico obbligatorio) e di un campione muscolare fresco raccolto dal centro di un muscolo posturale, contenente un'alta percentuale di fibre muscolari scheletriche di tipo I ricche di mitocondri e incubato in condizioni che si avvicinano al metabolismo a riposo (cioè 38 °C e pH 7,0). In queste condizioni, lo sperimentatore può aspettarsi valori di L N di 2,71 ± 0,90, valori di ...

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High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

I cavalli hanno un'eccezionale capacità di esercizio aerobico, rendendo il muscolo scheletrico equino un tessuto importante sia per lo studio della fisiologia dell'esercizio equino che per la fisiologia mitocondriale dei mammiferi. Questo articolo descrive le tecniche per la valutazione completa della funzione mitocondriale nel muscolo scheletrico equino.

Fluoro-respirometria ad alta risoluzione del muscolo scheletrico equino

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...

Questi protocolli consentono ai ricercatori di andare oltre la semplice misurazione del consumo di ossigeno mitocondriale e consentono invece la misurazione dei principali prodotti finali mitocondriali, ATP e specie reattive dell'ossigeno. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il ricercatore può misurare l'efficienza mitocondriale confrontando direttamente il tasso di consumo di ossigeno con il tasso di produzione del prodotto finale. Se il prodotto finale è ATP o ossigeno reattivo.Le tecniche richiedono un'attenzione molto attenta ai dettagli, in particolare per evitare le bolle. Che si trovino nella camera di respirazione o nelle siringhe di titolazione, le bolle sono il tuo nemico perché rendono le misurazioni meno precise. Dopo aver ottenuto le biopsie muscolari scheletriche.Riempire le camere respirometriche con supporti privi di magnesio e sigillare la camera di incubazione. Impostare la temperatura di incubazione dello strumento a 38 gradi Celsius per rappresentare la temperatura basale del muscolo scheletrico equino. E impostare la miscelazione del mezzo di respirazione a 750 giri / min utilizzando un movimento magnetico girando sul fondo della camera respirometrica.Quindi, spegnere l'illuminazione della camera per evitare interferenze con i sensori fluorescenti. Energizzare l'elettrodo di ossigeno con una tensione di polarizzazione di 800 millivolt e amplificare il segnale risultante con un'impostazione di guadagno di uno. Registrare la concentrazione di ossigeno ogni due secondi e calcolare il flusso di ossigeno come pendenza negativa della misurazione dell'ossigeno nei 40 secondi successivi.Quindi calibrare il sensore di ossigeno consentendo al fluido di equilibrarsi con l'aria ambiente. Calcolare la pressione parziale dell'ossigeno di riferimento in base alla pressione barometrica misurata dal respirometro ad alta risoluzione e dalla concentrazione standard di ossigeno atmosferico. Utilizzare sensori fluorescenti verdi per quantificare il segnale fluorescente proveniente dalla camera respiratoria.Energizzare i sensori da 400 a 500 millivolt e il segnale risultante viene amplificato con un guadagno da 1 a 1.000. Quindi, aggiungere TMRM alla camera di respirazione prima di aggiungere mitocondri e calibrare il segnale fluorescente utilizzando una semplice calibrazione a due punti del segnale fluorescente rispetto alla quantità di fluoroforo aggiunto prima dell'aggiunta dei mitocondri. Eseguire la calibrazione finale del segnale TMRM dopo il completamento del protocollo di titolazione respirometrica erogando diverse titolazioni dell'agente disaccoppiante fino a quando non si osservano ulteriori aumenti del segnale fluorescente TMRM che indicano il completo collasso del potenziale di membrana mitocondriale.Utilizzare sensori fluorescenti blu per quantificare il segnale fluorescente dalla camera respiratoria e energizzare questi sensori per i singoli strumenti per catturare il segnale atteso all'interno della gamma lineare del sensore. Aggiungere otto microlitri di EDTA a due millimolari alla camera respiratoria per chelare cationi che competerebbero con gli ioni di magnesio per legarsi al verde di magnesio. Quindi, aggiungere quattro microlitri di un verde di magnesio millimolare alla camera respiratoria.Calibrare il segnale fluorescente grezzo con titolazioni sequenziali da 10 x 2 microlitri di cloruro di magnesio 100 millimolari, lasciando un minuto tra le titolazioni per stabilizzare il segnale fluorescente. Determinare la velocità di sintesi di ATTP che è la pendenza della concentrazione di ATP nel tempo in tutto il protocollo. Utilizzare sensori fluorescenti verdi per quantificare il segnale fluorescente proveniente dalla camera respiratoria.Energizzare i sensori da 300 a 400 millivolt. E il segnale risultante viene amplificato con un guadagno da 1 a 1.000. Ottimizza impostazioni specifiche per i singoli strumenti per acquisire il segnale previsto all'interno della gamma lineare del sensore.Prima di aggiungere i mitocondri, eseguire la configurazione chimica e la calibrazione iniziale del test Amplex UltraRed. Aggiungere 30 micromoli di DTPA ai cationi chelati che potrebbero interferire con la reazione. Quindi aggiungere superossido dismutasi o perossidasi serratus e Amplex UltraRed nella camera respirometrica.Lasciare stabilizzare il segnale fluorescente. Quindi aggiungere 0,2 micromoli di perossido di idrogeno due volte con un intervallo di cinque minuti. Eseguire ulteriori calibrazioni a due punti durante il test per consentire la regolazione della reattività del saggio man mano che la chimica della respirometria cambia durante il test con la tempistica specifica di questi punti di calibrazione a discrezione dello sperimentatore.Vortice il campione per mantenere una sospensione uniforme del campione e aggiungere 15 microlitri di sospensione mitocondriale isolata a ciascuna camera di incubazione da due millilitri in modo che i risultati rappresentino la resa mitocondriale di 18,75 milligrammi di muscolo. Prima di aggiungere qualsiasi substrato, misurare il consumo di ossigeno residuo e sottrarre questo valore dai valori di consumo di ossigeno di ogni fase della titolazione dell'inibitore disaccoppiato del substrato o del protocollo SUIT dopo il completamento. Utilizzare una SUIT generica che consenta la caratterizzazione iniziale della funzione mitocondriale del muscolo scheletrico equino.Inizia con titolazioni sequenziali di piruvato, glutammato e malato l'uno nell'altro in ciascuna camera per produrre nicotinammide adenina dinucleotide e stimolare la respirazione non fosforilante supportata da NADH ossidato attraverso complesse perdite a base unica. Quindi aggiungere ADP per stimolare la respirazione fosforilante attraverso una respirazione fosforilante complessa. Aggiungere succinato per produrre la respirazione fosforilante combinando la respirazione fosforilante complessa e complessa due Aggiungere rotenone per bloccare il complesso.Il flusso di ossigeno risultante rappresenta la capacità del complesso due di supportare il consumo di ossigeno mitocondriale mediante l'ossidazione del solo succinato. Viene mostrata una traccia respirometrica ad alta risoluzione della respirazione mitocondriale del muscolo scheletrico equino e del relativo potenziale di membrana. I valori respiratori dei mitocondri incubati con TMRM sono più bassi a causa di un effetto inibitorio di quel fluoroforo.Vengono mostrate la respirazione mitocondriale e la sintesi di ATTP del muscolo scheletrico equino contenente un'alta percentuale di fibre muscolari scheletriche di tipo uno ricche di mitocondri e incubato in condizioni che si avvicinano al metabolismo a riposo. Viene mostrata la traccia respirometrica della respirazione mitocondriale del muscolo scheletrico equino e la produzione di perossido di idrogeno. La respirometria ad alta risoluzione richiede molta pazienza.La persona che esegue il test avrà numerosi punti temporali in cui deve effettuare una chiamata di giudizio in merito al raggiungimento di uno stato stazionario e al passaggio successivo. Abbiamo dimostrato un solo protocollo di titolazione. Ci sono dozzine di altri protocolli che possono essere applicati allo stesso modo per affrontare domande specifiche riguardanti il metabolismo mitocondriale.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Ricerca

Biologia

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Purificazione di progenitori dal muscolo scheletrico

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedure di Rat<em&gt; In situ</em&gt; Proprietà muscolatura scheletrica contrattili

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Vivo Valutazione Ex della contrattilità, affaticabilità e alternanza in isolati muscoli scheletrici

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-lesioni del muscolo scheletrico embrionale Zebrafish

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Valutazione del calcio Sparks in intatte fibre muscolari scheletriche

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

L&#39;isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolamento e caratterizzazione di esosomi da fibroblasti muscolari scheletrici

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Costruzione di un modello scheletrico equino realistico, a tutto corpo e tridimensionale utilizzando dati di tomografia computerizzata

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...