Name: high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle
Uploaded: 2023-02-03T14:40:00
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著者は、馬のスポーツ医学のためのジョンとデビーオクスリー寄付講座とグレイソンジョッキークラブ研究財団の寛大な支援に感謝したいと思います。

この研究は、オクラホマ州立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。この研究では、4頭のサラブレッド騸馬(17.5±1.3年、593±45 kg)を使用して、代表的な結果を生成しました。
1. 骨格筋生検標本の採取
<ol><li>半腱様筋(または他の関心のある筋肉)の中心から骨格筋生検(滅菌技術に従う)を取得し、軽い鎮静下で12 Gユニバーシティカレッ?...

<ol>
	<li>Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+muscle+approaching+maximal+rates+of+oxygen+utilization.">Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization.</a> Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , (2014).</li><li>Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+can+be+determined+in+individual+cells+from+the+nernstian+distribution+of+cationic+dyes.">Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes.</a> Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).</li><li>Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ADP-ATP+exchange+in+relation+to+mitochondrial+transmembrane+potential+and+oxygen+consumption.">Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).</li><li>Krumschnabel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).</li><li>Lemieux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+is+altered+in+horse+atypical+myopathy.">Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy.</a> Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).</li><li>Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+muscle+mitochondrial+respiratory+capacity+in+Standardbred+racehorses+as+an+aid+to+predicting+exertional+rhabdomyolysis.">Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis.</a> Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).</li><li>Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+fitness+and+mitochondrial+respiratory+capacity+in+horse+skeletal+muscle.">Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).</li><li>Votion, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+mitochondrial+respiratory+function+in+response+to+endurance+training+and+endurance+racing.">Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing.</a> Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).</li><li>Tosi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+capacity+in+horses+suffering+from+polysaccharide+storage+myopathy.">Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).</li><li>Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hyperthermia+and+acidosis+on+equine+skeletal+muscle+mitochondrial+oxygen+consumption.">Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption.</a> Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).</li><li>Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAPID+COMMUNICATION:+Differential+skeletal+muscle+mitochondrial+characteristics+of+weanling+racing-bred+horses1.">RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1.</a> Journal of Animal Science. , (2019).</li><li>White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submaximal+exercise+training+improves+mitochondrial+efficiency+in+the+gluteus+medius+but+not+in+the+triceps+brachii+of+young+equine+athletes.">Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).</li><li>White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+communication:+Dietary+selenium+improves+skeletal+muscle+mitochondrial+biogenesis+in+young+equine+athletes.">Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes.</a> Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).</li><li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+FluoRespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells,+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle,+and+isolated+mitochondria.">High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li><li>Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+mitochondrial+function+in+skeletal+muscle+of+American+American+Quarter+Horses.">Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses.</a> Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).</li><li>Komlodi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mitochondrial+incubation+media+for+measurement+of+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+physiology.">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetic Communications. , (2020).</li><li>Li Puma, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+oxygen+concentration+influences+rates+of+mitochondrial+hydrogen+peroxide+release+from+cardiac+and+skeletal+muscle+preparations.">Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).</li></ol>

高分解能呼吸計の標準出力に蛍光信号を追加することで、ミトコンドリア生理学に関する貴重な情報が得られますが、高品質のデータには蛍光信号の綿密な校正が不可欠です。MgGを使用するための元のプロトコルは、マグネシウム-アデニル酸解離定数の計算中に生成された検量線が後続のアッセイに適用できることを示唆しています4。しかしながら、MgGからの蛍光シグナ?...

真核細胞のミトコンドリアは、細胞が仕事と維持に使用するATPの大部分を産生します1。ATPのミトコンドリア産生における重要なステップは、酸素から水への変換であり、したがって、ミトコンドリアおよび関連細胞の代謝能力は、酸素消費量の測定を通じて頻繁に定量化されます2。しかし、ミトコンドリア生理学は酸素消費の単純なプロセスよりも複雑であり、このエンドポイントへの依存は、ミトコンドリア機能と機能障害が細胞の健康に与える影響の不完全な評価のみを提供します。ミトコンドリア機能の完全な特性評価には、酸素消費量だけでなく、ATPおよび活性酸素種(ROS)の産生も評価する必要があります。
重要なミトコンドリア機能の追加測定は、特定の蛍光色素を使用して呼吸の測定と同時に達成することができます。テトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM)は、ミトコンドリア膜貫通電位に比例してミトコンドリアマトリックスに蓄積するカチオン性蛍光団であり、この蓄積により蛍光強度が低下します3。TMRMは、ミトコンドリア膜電位の相対的変化の指標として使用することも、蛍光シグナルをmVに変換することを可能にする定数を決定するための追加の実験により膜貫通電圧の正確な変化を定量化するために使用することもできます。マグネシウムグリーン(MgG)は、Mg2+と結合すると蛍光を発する蛍光色素であり、マグネシウム二価陽イオン4に対するADPとATPの示差親和性に基づくATP合成の測定に使用されます。研究者は、特定の分析条件下でADPとATPの両方の特定の親和性/解離定数(Kd)を決定し、 MgG蛍光の変化をATP濃度の変化に変換します。アンプレックスUltraRed(AmR)は、ミトコンドリア呼吸中の過酸化水素およびその他のROSの生成を測定するために使用される蛍光色素です5。H 2 O2とAmR(西洋ワサビペルオキシダーゼによって触媒される)との間の反応は、530nMの蛍光によって検出可能なレゾルフィンを生成する。これらのアッセイのそれぞれを、ミトコンドリア生理学のそれぞれの側面の同時測定を提供するために、リアルタイムのミトコンドリア呼吸のアッセイに個別に追加することができ、したがって、呼吸とミトコンドリア出力との間の直接的なリンクを提供する。
馬は、馬の骨格筋のミトコンドリア含有量が非常に高いこともあり、質量特異的酸素消費量が非常に高いため、この組織はミトコンドリア生理学の研究に非常に関連性があります。高解像度の肺活量測定の開発により、この新しい技術を使用した研究は、馬の顕著な運動能力と骨格筋疾患の病態生理学の両方に対する馬の骨格筋ミトコンドリアの寄与を定義するのに役立ちました6,7,8,9,10,11,12,13,14 .ウマ骨格筋ミトコンドリア機能の研究は、この組織を大量に得ることが非終末であるため、特に有利である。したがって、ウマの被験者は、ミトコンドリア機能の完全な特徴付けに十分な組織を提供するだけでなく、ミトコンドリア生理学に関する高品質で機械的な研究のための縦断的コントロールとしても機能します。このため、ウマ骨格筋におけるミトコンドリア生理学のより堅牢な特徴付けを提供するために、ミトコンドリア膜電位、ATP合成、およびこの組織における酸素消費量の測定を補完するROSの産生を定量化するための追加のアッセイが開発されました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A5285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab 7.0</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software to operate O2K fluororespirometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>516813</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M3733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial isolation kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>MITOISO1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K fluororespirometer</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium lactobionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxide dismutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration pump</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration syringes</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T5428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCH biopsy needle</td>
			<td>Millenium Surgical Corp</td>
			<td>72-238067</td>
			<td>Available in a range of sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle

ミトコンドリアの機能(酸化的リン酸化と活性酸素種の生成)は、健康と病気の両方において重要です。したがって、ミトコンドリア機能の測定は生物医学研究の基本です。骨格筋は、特に馬などの非常に高い有酸素能力を持つ動物において、ミトコンドリアの強力な供給源であり、ミトコンドリア生理学を研究するための理想的な対象となっています。この記事では、採取したばかりの骨格筋ミトコンドリアを使用した同時蛍光測定を伴う高分解能呼吸留置法を使用して、さまざまなミトコンドリア状態下で基質を酸化する能力を定量化し、ミトコンドリア呼吸の異なる要素の相対容量を決定する方法を示します。テトラメチルローダミンメチルエステルは、同時酸素フラックスの単位あたりに生成される相対膜電位を計算することによるミトコンドリアの相対効率の計算を含む、基質酸化に起因するミトコンドリア膜電位の生成を実証するために使用されます。ADPからATPへの変換は、マグネシウムに対するアデニル酸塩の親和性が異なるため、反応チャンバー内のマグネシウム濃度の変化をもたらします。したがって、マグネシウムグリーンを使用してATP合成速度を測定することができ、酸化的リン酸化効率(リン酸化と酸化の比率[P / O])をさらに計算できます。最後に、過酸化水素と組み合わせると蛍光生成物(レゾルフィン)を生成するAmplex UltraRedを使用することで、ミトコンドリア呼吸中の活性酸素種の産生、およびROS産生と同時呼吸の関係を定量化できます。これらの技術は、さまざまな異なるシミュレート条件下でのミトコンドリア生理機能の堅牢な定量を可能にし、健康と病気の両方に対するこの重要な細胞成分の寄与に光を当てます。

提案された基準状態は、健康な座りがちなサラブレッド(強制運動によるフィットネスの増加なし)と、ミトコンドリアに富むI型骨格筋繊維を高い割合で含み、安静時代謝に近い条件(すなわち、38°CおよびpH 7.0)でインキュベートされた姿勢筋の中心から収集された新鮮な筋肉サンプルです。これらの条件下で、研究者はL N値が2.71±0.90、PN 値が62.40 ± 26.22、PN + S値が93.67 ...

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High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

馬は並外れた有酸素運動能力を持っているため、馬の骨格筋は、馬の運動生理学と哺乳類のミトコンドリア生理学の両方の研究にとって重要な組織となっています。この記事では、馬の骨格筋におけるミトコンドリア機能の包括的な評価のための技術について説明します。

ウマ骨格筋の高分解能蛍光呼吸測定

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...

これらのプロトコルにより、研究者は単にミトコンドリアの酸素消費量を測定するだけでなく、主要なミトコンドリアの最終産物、ATP、活性酸素種の測定が可能になります。この技術の主な利点は、研究者が酸素消費速度を最終製品生産速度と直接比較することにより、ミトコンドリア効率を測定できることです。最終製品がATPか活性酸素か。テクニックは、特に気泡を避けるために、細部に非常に注意深い注意を払う必要があります。呼吸室であろうと滴定注射器であろうと、気泡は測定の精度を低下させるため、敵です。骨格筋生検を取得した後。呼吸計チャンバーをマグネシウムフリーの培地で満たし、インキュベーションチャンバーを密閉します。機器のインキュベーション温度を摂氏38度に設定して、馬の骨格筋の基礎温度を表します。呼吸法チャンバーの底部で回転する磁気攪拌を用いて呼吸媒体の混合を750rpmに設定した。次に、蛍光センサーとの干渉を避けるためにチャンバー照明をオフにします。800ミリボルトの分極電圧で酸素電極に通電し、得られた信号を1のゲイン設定で増幅します。2秒ごとに酸素濃度を記録し、酸素フラックスを40秒間にわたる酸素測定の負の傾きとして計算します。次に、メディアが室内の空気と平衡になるようにして、酸素センサーを調整します。高解像度呼吸計で測定した気圧と標準大気酸素濃度に基づいて、基準酸素分圧を計算します。緑色の蛍光センサーを使用して、呼吸室からの蛍光信号を定量化します。400〜500ミリボルトでセンサーに通電すると、結果の信号が1〜1, 000のゲインで増幅されます。次に、ミトコンドリアを添加する前にTMRMを呼吸室に添加し、蛍光シグナルとミトコンドリア添加前の蛍光色素添加量の簡単な2点校正を用いて蛍光シグナルを較正します。呼吸滴定プロトコルの完了後、ミトコンドリア膜電位の完全な崩壊を示すTMRM蛍光シグナルのさらなる増加が観察されなくなるまで、脱共役剤の滴定を数回送達することにより、TMRMシグナルの最終較正を実行します。青色蛍光センサーを使用して、呼吸室からの蛍光信号を定量化し、個々の機器に対してこれらのセンサーに電力を供給して、センサーの線形範囲内で予想される信号をキャプチャします。8マイクロリットルの2ミリモルEDTAを呼吸室に追加して、マグネシウムグリーンへの結合についてマグネシウムイオンと競合する陽イオンをキレートします。次に、4マイクロリットルの1ミリモルマグネシウムグリーンを呼吸室に加えます。100ミリモルの塩化マグネシウムを10 x 2マイクロリットルの連続滴定で生の蛍光シグナルを校正し、滴定の間に1分間待って蛍光シグナルを安定させます。プロトコル全体にわたるATPの濃度の経時的な傾きであるATTP合成速度を決定します。緑色の蛍光センサーを使用して、呼吸室からの蛍光信号を定量化します。300〜400ミリボルトでセンサーに通電します。そして、結果として生じる信号は、1〜1, 000のゲインで増幅されます。個々の計測器の特定の設定を最適化して、センサーの線形範囲内で予想される信号をキャプチャします。ミトコンドリアを添加する前に、アンプレックスUltraRedアッセイの化学的セットアップと初期キャリブレーションを実行します。30マイクロモルのDTPAを加えて、反応を妨げる可能性のある陽イオンをキレートします。次に、スーパーオキシドジスムターゼまたはセラタスペルオキシダーゼとアンプレックスUltraRedを呼吸測定チャンバーに追加します。蛍光シグナルが安定するまで待ちます。次に、0.2マイクロモルの過酸化水素を5分間隔で2回加えます。アッセイ全体で追加の2点キャリブレーションを実行して、研究者の裁量でこれらのキャリブレーションポイントの特定のタイミングで呼吸測定の化学的性質がアッセイ全体で変化するにつれて、アッセイの応答性を調整できるようにします。均一なサンプル懸濁液を維持するためにサンプルをボルテックスし、15マイクロリットルの単離されたミトコンドリア懸濁液を各2ミリリットルのインキュベーションチャンバーに追加して、結果が18.75ミリグラムの筋肉のミトコンドリア収量を表すようにします。基質を添加する前に、残留酸素消費量を測定し、完了後の基質非共役阻害剤滴定またはSUITプロトコルの各ステップの酸素消費量値からこの値を差し引きます。馬の骨格筋ミトコンドリア機能の初期特性評価を可能にする汎用SUITを使用してください。ピルビン酸、グルタミン酸、リンゴ酸塩を各チャンバーに順次滴定してニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生成し、複雑な1ベースのリークを介して酸化されたNADHによってサポートされる非リン酸化呼吸を刺激します。次にADPを追加して、複雑なものを介してリン酸化呼吸を刺激します リン酸化呼吸。コハク酸塩を追加して、複合体1と複合体2のリン酸化呼吸を組み合わせてリン酸化呼吸を生成します 複合体1をブロックするためにロテノンを追加します。得られた酸素フラックスは、コハク酸塩単独の酸化によるミトコンドリア酸素消費を支持する複合体2の能力を表す。ウマ骨格筋ミトコンドリア呼吸および相対膜電位の高解像度呼吸測定トレースが示されている。TMRMでインキュベートしたミトコンドリアの呼吸値は、その蛍光色素の阻害効果により低くなります。ミトコンドリア高含有タイプ1骨格筋線維を高い割合で含有し、安静時代謝に近い条件下でインキュベートしたウマ骨格筋のミトコンドリア呼吸およびATTP合成が示されている。ウマ骨格筋ミトコンドリア呼吸および過酸化水素産生の呼吸測定トレースが示されている。高解像度の肺活量測定には多くの忍耐が必要です。アッセイを実行する人には、定常状態に達し、次のステップが発生する可能性があるかどうかについて判断を下す必要がある多くの時点があります。単一の滴定プロトコルのみを示しました。ミトコンドリア代謝に関する特定の質問に対処するために同じ方法で適用できるプロトコルはさらに数十あります。

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

生物学

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

骨格筋からのミトコンドリア単離

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

骨格筋からの前駆体の精製

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

ラットのための手順<em&gt;その場で</em&gt;骨格筋収縮特性

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

ゼブラフィッシュ胚骨格筋のレーザー招いた傷害

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

無傷骨格筋線維内のカルシウムスパークスの評価

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

骨格筋線維芽細胞からのエクソソームの単離と特性評価

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

コンピュータ断層撮影データを用いたリアルな全身3次元馬骨格モデルの構築

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...