Name: high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle
Uploaded: 2023-02-03T14:40:00
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저자는 John and Debbie Oxley Endowed Chair for Equine Sports Medicine과 Grayson Jockey Club Research Foundation의 아낌없는 지원에 감사드립니다.

이 연구는 오클라호마 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구에서는 4개의 서러브레드 겔딩(17.5 ± 1.3년, 593 ± 45kg)을 사용하여 대표적인 결과를 생성했습니다.
1. 골격근 생검 표본 얻기
<ol><li>반건공룡근(또는 다른 관심 근육)의 중심에서 골격근 생검(멸균 기술 따름)을 얻고, 가벼운 진정 상태에서 12G UCH(University College Hospital) 생?...

<ol>
	<li>Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+muscle+approaching+maximal+rates+of+oxygen+utilization.">Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization.</a> Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , (2014).</li><li>Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+can+be+determined+in+individual+cells+from+the+nernstian+distribution+of+cationic+dyes.">Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes.</a> Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).</li><li>Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ADP-ATP+exchange+in+relation+to+mitochondrial+transmembrane+potential+and+oxygen+consumption.">Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).</li><li>Krumschnabel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).</li><li>Lemieux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+is+altered+in+horse+atypical+myopathy.">Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy.</a> Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).</li><li>Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+muscle+mitochondrial+respiratory+capacity+in+Standardbred+racehorses+as+an+aid+to+predicting+exertional+rhabdomyolysis.">Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis.</a> Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).</li><li>Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+fitness+and+mitochondrial+respiratory+capacity+in+horse+skeletal+muscle.">Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).</li><li>Votion, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+mitochondrial+respiratory+function+in+response+to+endurance+training+and+endurance+racing.">Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing.</a> Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).</li><li>Tosi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+capacity+in+horses+suffering+from+polysaccharide+storage+myopathy.">Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).</li><li>Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hyperthermia+and+acidosis+on+equine+skeletal+muscle+mitochondrial+oxygen+consumption.">Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption.</a> Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).</li><li>Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAPID+COMMUNICATION:+Differential+skeletal+muscle+mitochondrial+characteristics+of+weanling+racing-bred+horses1.">RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1.</a> Journal of Animal Science. , (2019).</li><li>White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submaximal+exercise+training+improves+mitochondrial+efficiency+in+the+gluteus+medius+but+not+in+the+triceps+brachii+of+young+equine+athletes.">Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).</li><li>White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+communication:+Dietary+selenium+improves+skeletal+muscle+mitochondrial+biogenesis+in+young+equine+athletes.">Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes.</a> Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).</li><li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+FluoRespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells,+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle,+and+isolated+mitochondria.">High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li><li>Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+mitochondrial+function+in+skeletal+muscle+of+American+American+Quarter+Horses.">Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses.</a> Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).</li><li>Komlodi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mitochondrial+incubation+media+for+measurement+of+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+physiology.">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetic Communications. , (2020).</li><li>Li Puma, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+oxygen+concentration+influences+rates+of+mitochondrial+hydrogen+peroxide+release+from+cardiac+and+skeletal+muscle+preparations.">Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).</li></ol>

고분해능 호흡기의 표준 출력에 형광 신호를 추가하면 미토콘드리아 생리학에 관한 귀중한 정보를 얻을 수 있지만, 형광 신호의 세심한 보정은 양질의 데이터를 위해 매우 중요합니다. MgG 사용에 대한 원래의 프로토콜은 마그네슘-아데닐레이트 해리 상수를 계산하는 동안 생성된 검량선이 후속 분석에 적용될 수 있음을 시사한다4; 그러나 MgG의 형광 신호는 이 접근법에 대한 분?...

진핵 세포의 미토콘드리아는 세포가 일과 유지를 위해 사용하는 ATP의 대부분을 생산한다1. ATP의 미토콘드리아 생산의 핵심 단계는 산소를 물로 전환하는 것이므로, 미토콘드리아와 관련 세포의 대사 능력은 산소 소비량 측정을 통해 자주 정량화된다2. 그러나 미토콘드리아 생리학은 단순한 산소 소비 과정보다 더 복잡하며 이 종점에 대한 의존은 미토콘드리아 기능과 기능 장애가 세포 건강에 미치는 영향에 대한 불완전한 평가를 독점적으로 제공합니다. 미토콘드리아 기능의 완전한 특성화는 산소 소비뿐만 아니라 ATP 및 활성 산소 종(ROS)의 생성에 대한 평가도 필요로 합니다.
주요 미토콘드리아 기능의 추가 측정은 특정 형광단의 사용을 통한 호흡 측정과 동시에 수행될 수 있습니다. 테트라메틸로다민 메틸에스테르(Tetramethylrhodamine methylester, TMRM)는 미토콘드리아 막횡단 전압 전위에 비례하여 미토콘드리아 기질에 축적되는 양이온성 형광단으로, 이 축적으로 인해 형광 강도가 감소한다3. TMRM은 미토콘드리아 막 전위의 상대적 변화를 나타내는 지표로 사용되거나, 형광 신호를 mV로 변환할 수 있는 상수를 결정하기 위한 추가 실험을 통해 막횡단 전압의 정확한 변화를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 마그네슘 그린(MgG)은 Mg2+와 결합할 때 형광을 발하는 형광단으로, 마그네슘 2가 양이온4에 대한 ADP와 ATP의 미분 친화도를 기반으로 ATP 합성 측정에 사용됩니다. 조사관은 MgG 형광의 변화를 ATP 농도의 변화로 변환하기 위해 특정 분석 조건에서 ADP와 ATP 모두에 대한 특정 친화도/해리 상수(Kd)를 결정해야 합니다. Amplex UltraRed(AmR)는 미토콘드리아 호흡 중 과산화수소 및 기타 ROS의 생성을 측정하는 데 사용되는 형광단이다5. H 2 O2와 AmR (양 고추 냉이 과산화 효소에 의해 촉매 됨) 사이의 반응은 530 nM에서 형광을 통해 검출 가능한 레소 루핀을 생성합니다. 이러한 각 분석은 실시간 미토콘드리아 호흡 분석에 개별적으로 추가되어 미토콘드리아 생리학의 각 측면에 대한 동시 측정을 제공하여 호흡과 미토콘드리아 출력 사이의 직접적인 연결을 제공할 수 있습니다.
말은 부분적으로 말 골격근의 미토콘드리아 함량이 매우 높기 때문에 질량별 산소 소비율이 매우 높기 때문에 이 조직은 미토콘드리아 생리학 연구와 매우 관련이 있습니다. 고해상도 호흡 측정법의 개발과 함께 이 새로운 기술을 사용한 연구는 말의 놀라운 운동 능력과 골격근 질환의 병태생리학 모두에 대한 말 골격근 미토콘드리아의 기여를 정의하는 데 도움이 되었습니다 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . 말 골격근 미토콘드리아 기능에 대한 연구는 이 조직을 다량 얻는 것이 말단이 아니기 때문에 특히 유리합니다. 따라서 말 피험자는 미토콘드리아 기능의 완전한 특성화를 위한 충분한 조직을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 미토콘드리아 생리학에 대한 고품질의 기계론적 연구를 위한 종단 제어 역할도 할 수 있습니다. 이러한 이유로 말 골격근에서 미토콘드리아 생리학의 보다 강력한 특성을 제공하기 위해 미토콘드리아 막 전위, ATP 합성 및 이 조직의 산소 소비 측정을 보완하는 ROS 생성을 정량화하기 위한 추가 분석이 개발되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A5285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab 7.0</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software to operate O2K fluororespirometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>516813</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M3733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial isolation kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>MITOISO1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K fluororespirometer</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium lactobionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxide dismutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration pump</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration syringes</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T5428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCH biopsy needle</td>
			<td>Millenium Surgical Corp</td>
			<td>72-238067</td>
			<td>Available in a range of sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle

미토콘드리아 기능(산화적 인산화 및 활성 산소 종의 생성)은 건강과 질병 모두에 중요합니다. 따라서 미토콘드리아 기능을 측정하는 것은 생물 의학 연구의 기본입니다. 골격근은 특히 말과 같이 유산소 능력이 매우 높은 동물에서 미토콘드리아의 강력한 공급원이므로 미토콘드리아 생리학을 연구하는 데 이상적인 과목입니다. 이 기사는 갓 수확한 골격근 미토콘드리아와 함께 동시 형광 측정법과 함께 고해상도 호흡 측정법을 사용하여 다양한 미토콘드리아 상태에서 기질을 산화시키는 능력을 정량화하고 미토콘드리아 호흡의 고유한 요소의 상대적 용량을 결정하는 방법을 보여줍니다. 테트라메틸로다민 메틸에스테르는 동시 산소 플럭스 단위당 생성된 상대적 막 전위를 계산하여 미토콘드리아의 상대적 효율 계산을 포함하여 기질 산화로 인한 미토콘드리아 막 전위의 생성을 입증하는 데 사용됩니다. ADP를 ATP로 전환하면 마그네슘에 대한 아데닐레이트의 친화도가 다르기 때문에 반응 챔버에서 마그네슘 농도가 변경됩니다. 따라서 마그네슘 그린은 ATP 합성 속도를 측정하는 데 사용할 수 있으므로 산화 인산화 효율(산화에 대한 인산화의 비율[P/O])을 추가로 계산할 수 있습니다. 마지막으로, 과산화수소와 결합하면 형광 생성물(레소루핀)을 생성하는 Amplex UltraRed를 사용하면 미토콘드리아 호흡 중 활성 산소 종 생성의 정량화와 ROS 생성과 동시 호흡 간의 관계를 정량화할 수 있습니다. 이러한 기술을 통해 다양한 시뮬레이션 조건에서 미토콘드리아 생리학을 강력하게 정량화할 수 있으므로 이 중요한 세포 구성 요소가 건강과 질병 모두에 기여하는 바를 밝힐 수 있습니다.

제안된 기준 상태는 건강한 좌식 서러브레드(의무 운동으로 인한 체력 증가 없음)와 자세 근육의 중심에서 수집된 신선한 근육 샘플로, 높은 비율의 미토콘드리아가 풍부한 I형 골격근 섬유를 함유하고 휴식 신진대사에 가까운 조건(즉, 38°C 및 pH 7.0). 이러한 조건에서 연구자는 2.71 ± 0.90의 LN 값, 62.40 ± 26.22의 PN 값, 93.67 ± 34.76의PN+S 값 및 46.93 ± 14.58 pmol O2 x s-1 x <sup...

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High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

말은 뛰어난 유산소 운동 능력을 가지고 있어 말 골격근을 말 운동 생리학 연구와 포유류 미토콘드리아 생리학 연구 모두에 중요한 조직으로 만듭니다. 이 기사에서는 말 골격근의 미토콘드리아 기능을 종합적으로 평가하는 기술을 설명합니다.

말 골격근의 고분해능 불소 호흡 측정

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...

이러한 프로토콜을 통해 조사관은 단순히 미토콘드리아 산소 소비량을 측정하는 것을 넘어 주요 미토콘드리아 최종 산물인 ATP 및 활성 산소 종의 측정을 허용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자가 산소 소비율을 최종 제품 생산 속도와 직접 비교하여 미토콘드리아 효율성을 측정할 수 있다는 것입니다. 최종 생성물이 ATP인지 활성 산소인지 여부.이 기술은 특히 기포를 피하기 위해 세부 사항에 매우 세심한 주의가 필요합니다. 호흡실에 있든 적정 주사기에 있든 기포는 측정의 정확성을 떨어뜨리기 때문에 적입니다. 골격근 생검을 얻은 후.호흡계 챔버를 마그네슘이 없는 배지로 채우고 배양 챔버를 밀봉합니다. 말 골격근의 기저 온도를 나타내기 위해 기구 배양 온도를 섭씨 38도로 설정합니다. 호흡 매체의 혼합을 호흡계 챔버의 바닥에서 회전하는 자석 교반을 사용하여 750 rpm으로 설정한다.그런 다음 형광 센서와의 간섭을 피하기 위해 챔버 조명을 끕니다. 800mV 분극 전압으로 산소 전극에 전원을 공급하고 이득 설정 1로 결과 신호를 증폭합니다. 2초마다 산소 농도를 기록하고 40초 동안 진행된 산소 측정의 음의 기울기로 산소 플럭스를 계산합니다.그런 다음 매체가 실내 공기와 평형을 이루도록 하여 산소 센서를 보정합니다. 고해상도 호흡계로 측정한 기압과 표준 대기 산소 농도를 기준으로 기준 산소 분압을 계산합니다. 녹색 형광 센서를 사용하여 호흡실의 형광 신호를 정량화합니다.400 - 500 밀리볼트에서 센서에 전원을 공급하면 결과 신호가 1 - 1, 000의 이득으로 증폭됩니다. 다음으로, 미토콘드리아를 추가하기 전에 호흡 챔버에 TMRM을 추가하고 미토콘드리아를 추가하기 전에 추가된 형광단의 양에 대한 형광 신호의 간단한 2점 보정을 사용하여 형광 신호를 보정합니다. 미토콘드리아 막 전위의 완전한 붕괴를 나타내는 TMRM 형광 신호의 추가 증가가 관찰되지 않을 때까지 분리제의 여러 적정을 전달하여 호흡 측정 적정 프로토콜 완료 후 TMRM 신호의 최종 보정을 수행합니다.청색 형광 센서를 사용하여 호흡실의 형광 신호를 정량화하고 개별 기기에 대해 이러한 센서에 전원을 공급하여 센서의 선형 범위 내에서 예상되는 신호를 캡처합니다. 8 마이크로 리터의 2 밀리몰 EDTA를 호흡 챔버에 첨가하여 마그네슘 이온과 경쟁하여 마그네슘 그린에 결합하는 양이온을 킬레이트화합니다. 그런 다음 4 마이크로 리터의 1 밀리몰 마그네슘 그린을 호흡 챔버에 추가합니다.100 밀리몰 염화마그네슘의 10 x 2 마이크로리터 순차 적정으로 원시 형광 신호를 보정하고, 적정 사이에 1분 동안 형광 신호를 안정화합니다. 프로토콜 전반에 걸쳐 시간 경과에 따른 ATP 농도의 기울기인 ATTP 합성 속도를 결정합니다. 녹색 형광 센서를 사용하여 호흡실의 형광 신호를 정량화합니다.300-400 밀리볼트로 센서에 전원을 공급합니다. 그리고 결과 신호는 1에서 1, 000의 이득으로 증폭됩니다. 개별 계측기에 대한 특정 설정을 최적화하여 센서의 선형 범위 내에서 예상 신호를 캡처합니다.미토콘드리아를 추가하기 전에 Amplex UltraRed Assay의 화학적 설정 및 초기 보정을 수행합니다. 반응을 방해할 수 있는 양이온을 킬레이트화하기 위해 30마이크로몰의 DTPA를 추가합니다. 그런 다음 호흡 측정 챔버에 superoxide dismutase 또는 serratus peroxidase 및 Amplex UltraRed를 추가합니다.형광 신호가 안정화되도록 합니다. 그런 다음 0.2 마이크로 몰의 과산화수소를 5 분 간격으로 두 번 첨가하십시오. 조사자의 재량에 따라 이러한 보정 지점의 특정 타이밍과 함께 분석 전반에 걸쳐 호흡 측정의 화학적 성질이 변경됨에 따라 분석의 반응성을 조정할 수 있도록 분석 전반에 걸쳐 추가 2점 보정을 수행합니다.샘플을 와동시켜 균일한 샘플 현탁액을 유지하고, 15 마이크로리터의 단리된 미토콘드리아 현탁액을 각각의 2 밀리리터 배양 챔버에 첨가하여 결과가 18.75 밀리그램의 근육의 미토콘드리아 수율을 나타내도록 한다. 기질을 추가하기 전에 잔류 산소 소비량을 측정하고 완료 후 기질 비결합 억제제 적정 또는 SUIT 프로토콜의 각 단계의 산소 소비량 값에서 이 값을 뺍니다. 말 골격근 미토콘드리아 기능의 초기 특성화를 허용하는 범용 SUIT를 사용하십시오.피루브산, 글루타메이트 및 말산염을 각 챔버로 순차적으로 적정하여 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드를 생성하고 복잡한 1 기반 누출을 통해 산화된 NADH에 의해 지원되는 비인산화 호흡을 자극합니다. 그런 다음 ADP를 추가하여 복잡한 인산화 호흡을 통해 인산화 호흡을 자극합니다. 숙신산을 첨가하여 복합체 1과 복합체 2를 결합하여 인산화 호흡을 생성하고 복합체 1을 차단하기 위해 로테논을 추가합니다.생성된 산소 플럭스는 숙시네이트 단독의 산화에 의해 미토콘드리아 산소 소비를 지원하는 복합체 2의 용량을 나타냅니다. 말 골격근, 미토콘드리아 호흡 및 상대적인 막 전위의 고해상도 호흡 측정 흔적이 표시됩니다. TMRM과 함께 배양된 미토콘드리아의 호흡 값은 해당 형광단의 억제 효과로 인해 더 낮습니다.미토콘드리아 호흡 및 ATTP 합성은 높은 비율의 미토콘드리아가 풍부한 제1형 골격근 섬유를 함유하고 휴식 대사에 가까운 조건에서 배양된 말 골격근의 합성을 나타낸다. 말 골격근, 미토콘드리아 호흡 및 과산화수소 생성의 호흡 측정 흔적이 표시됩니다. 고해상도 호흡 측정법은 많은 인내가 필요합니다.분석을 실행하는 사람은 정상 상태에 도달했는지 여부와 다음 단계가 발생할 수 있는지에 대한 판단을 내려야 하는 수많은 시점을 갖게 됩니다. 지금까지 단 하나의 적정 프로토콜만 시연했습니다. 미토콘드리아 대사에 관한 특정 질문을 해결하기 위해 동일한 방식으로 적용할 수 있는 수십 가지 프로토콜이 더 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

연구

생물학

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

골격근에서 Mitochondrial 절연

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

골격근에서 Progenitors의 정화

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

쥐 절차<em&gt; 현장에서</em&gt; 골격근 수축 등록

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

절연 골격근의 수축성, Fatigability 및 Alternans의 예 VIVO 평가

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

칼슘의 평가는 그대로 골격 근육 섬유에서 불꽃

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

컴퓨터 단층 촬영 데이터를 사용하여 현실적이고 전신, 입체 말 골격 모델 구축

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...