Name: high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle
Uploaded: 2023-02-03T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle at JoVE.com

Forfatterne ønsker å anerkjenne den sjenerøse støtten fra John og Debbie Oxley Endowed Chair for Equine Sports Medicine og Grayson Jockey Club Research Foundation.

Denne studien ble godkjent av Oklahoma State University Institutional Animal Care and Use Committee. Fire fullblodsvallaker (17,5 ± 1,3 år, 593 ± 45 kg) ble brukt i denne studien for å generere de representative resultatene.
1. Innhenting av skjelettmuskulaturbiopsiprøve
<ol><li>Hent skjelettmuskelbiopsier (følg steril teknikk) fra midten av semitendinosusmuskelen (eller annen muskel av interesse), ved hjelp av en 12 G University College Hospital (UCH) biopsinål (se <...

<ol>
	<li>Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+muscle+approaching+maximal+rates+of+oxygen+utilization.">Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization.</a> Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , (2014).</li><li>Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+can+be+determined+in+individual+cells+from+the+nernstian+distribution+of+cationic+dyes.">Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes.</a> Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).</li><li>Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ADP-ATP+exchange+in+relation+to+mitochondrial+transmembrane+potential+and+oxygen+consumption.">Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).</li><li>Krumschnabel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).</li><li>Lemieux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+is+altered+in+horse+atypical+myopathy.">Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy.</a> Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).</li><li>Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+muscle+mitochondrial+respiratory+capacity+in+Standardbred+racehorses+as+an+aid+to+predicting+exertional+rhabdomyolysis.">Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis.</a> Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).</li><li>Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+fitness+and+mitochondrial+respiratory+capacity+in+horse+skeletal+muscle.">Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).</li><li>Votion, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+mitochondrial+respiratory+function+in+response+to+endurance+training+and+endurance+racing.">Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing.</a> Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).</li><li>Tosi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+capacity+in+horses+suffering+from+polysaccharide+storage+myopathy.">Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).</li><li>Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hyperthermia+and+acidosis+on+equine+skeletal+muscle+mitochondrial+oxygen+consumption.">Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption.</a> Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).</li><li>Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAPID+COMMUNICATION:+Differential+skeletal+muscle+mitochondrial+characteristics+of+weanling+racing-bred+horses1.">RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1.</a> Journal of Animal Science. , (2019).</li><li>White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submaximal+exercise+training+improves+mitochondrial+efficiency+in+the+gluteus+medius+but+not+in+the+triceps+brachii+of+young+equine+athletes.">Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).</li><li>White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+communication:+Dietary+selenium+improves+skeletal+muscle+mitochondrial+biogenesis+in+young+equine+athletes.">Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes.</a> Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).</li><li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+FluoRespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells,+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle,+and+isolated+mitochondria.">High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li><li>Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+mitochondrial+function+in+skeletal+muscle+of+American+American+Quarter+Horses.">Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses.</a> Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).</li><li>Komlodi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mitochondrial+incubation+media+for+measurement+of+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+physiology.">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetic Communications. , (2020).</li><li>Li Puma, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+oxygen+concentration+influences+rates+of+mitochondrial+hydrogen+peroxide+release+from+cardiac+and+skeletal+muscle+preparations.">Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).</li></ol>

Tilsetningen av fluorescerende signaler til standardutgangen til det høyoppløselige respirometeret gir verdifull informasjon om mitokondriell fysiologi, men omhyggelig kalibrering av det fluorescerende signalet er avgjørende for kvalitetsdata. De opprinnelige protokollene for bruk av MgG antyder at kalibreringskurvene generert under beregning av magnesium-adenylatdissosiasjonskonstanter kan brukes på etterfølgende analyser4; Det fluorescerende signalet fra MgG kan imidlertid ikke være tilstr...

Mitokondriene av eukaryote celler produserer flertallet av ATP som brukes av cellene til arbeid og vedlikehold1. Et sentralt trinn i mitokondrieproduksjonen av ATP er omdannelsen av oksygen til vann, og dermed blir den metabolske kapasiteten til mitokondrier og de tilknyttede cellene ofte kvantifisert gjennom måling av oksygenforbruk2. Mitokondriefysiologi er imidlertid mer kompleks enn den enkle prosessen med oksygenforbruk, og avhengighet av dette endepunktet gir utelukkende en ufullstendig vurdering av virkningen av mitokondriell funksjon og dysfunksjon på cellulær helse. Full karakterisering av mitokondriell funksjon krever vurdering av ikke bare oksygenforbruk, men også produksjon av ATP samt reaktive oksygenarter (ROS).
Ytterligere målinger av viktige mitokondrielle funksjoner kan oppnås samtidig med måling av respirasjon ved bruk av spesifikke fluoroforer. Tetrametylrhodaminmetylester (TMRM) er en kationisk fluorofor som akkumuleres i mitokondriematrisen i forhold til mitokondriell transmembranspenningspotensial, noe som resulterer i en reduksjon i fluorescerende intensitet på grunn av denne akkumuleringen3. TMRM kan brukes som en indikator på relative endringer i mitokondriemembranpotensial, eller kan brukes til å kvantifisere presise endringer i transmembranspenning med ytterligere eksperimenter for å bestemme konstanter som tillater konvertering av det fluorescerende signalet til mV. Magnesiumgrønn (MgG) er en fluorofor som fluoresces når den er bundet med Mg2+, og brukes til målinger av ATP-syntese basert på differensialaffiniteten til ADP og ATP for magnesiumdivalent kation4. Etterforskere må bestemme de spesifikke affinitets- / dissosiasjonskonstantene (Kd) for både ADP og ATP under spesifikke analytiske forhold for å konvertere endringene i MgG-fluorescens til en endring i ATP-konsentrasjon. Amplex UltraRed (AmR) er fluoroforen som brukes til å måle produksjonen av hydrogenperoksid og annen ROS under mitokondriell respirasjon5. Reaksjonen mellomH2O2og AmR (som katalyseres av pepperrotperoksidase) produserer resorufin, som kan påvises gjennom fluorescens ved 530 nM. Hver av disse analysene kan legges individuelt til analyser av sanntids mitokondriell respirasjon, for å gi samtidige målinger av de respektive aspektene av mitokondriell fysiologi, og dermed gi en direkte sammenheng mellom respirasjon og mitokondriell utgang.
Hester er i stand til svært høye nivåer av massespesifikt oksygenforbruk, delvis på grunn av det svært høye mitokondrielle innholdet i hestens skjelettmuskulatur, noe som gjør dette vevet svært relevant for å studere mitokondriell fysiologi. Med utviklingen av høyoppløselig respirometri har studier ved hjelp av denne nye teknologien bidratt til å definere bidragene fra hesteskjelettmuskulaturmitokondrier til både hestens bemerkelsesverdige treningskapasitet og patofysiologien til skjelettmuskelsykdommer 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Studier av hesteskjelettmuskulaturens mitokondriefunksjon er spesielt fordelaktige, da det å skaffe store mengder av dette vevet ikke er terminalt. Dermed kan hestefag ikke bare gi tilstrekkelig vev for fullstendig karakterisering av mitokondriell funksjon, men også tjene som langsgående kontroller for høykvalitets, mekanistiske studier i mitokondriell fysiologi. Av denne grunn er det utviklet ytterligere analyser for å kvantifisere mitokondriemembranpotensial, ATP-syntese og produksjon av ROS som utfyller måling av oksygenforbruk i dette vevet, for å gi en mer robust karakterisering av mitokondriefysiologi i hesteskjelettmuskulatur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A5285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab 7.0</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software to operate O2K fluororespirometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>516813</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M3733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial isolation kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>MITOISO1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K fluororespirometer</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium lactobionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxide dismutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration pump</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration syringes</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T5428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCH biopsy needle</td>
			<td>Millenium Surgical Corp</td>
			<td>72-238067</td>
			<td>Available in a range of sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle

Mitokondriell funksjon - oksidativ fosforylering og generering av reaktive oksygenarter - er kritisk i både helse og sykdom. Dermed er måling av mitokondriell funksjon grunnleggende i biomedisinsk forskning. Skjelettmuskulatur er en robust kilde til mitokondrier, spesielt hos dyr med svært høy aerob kapasitet, som hester, noe som gjør dem ideelle for å studere mitokondriell fysiologi. Denne artikkelen demonstrerer bruken av høyoppløselig respirometri med samtidig fluorometri, med nyhøstet skjelettmuskulaturmitokondrier, for å kvantifisere kapasiteten til å oksidere substrater under forskjellige mitokondrielle tilstander og bestemme den relative kapasiteten til forskjellige elementer av mitokondriell respirasjon. Tetrametylrhodaminmetylester brukes til å demonstrere produksjonen av mitokondriemembranpotensial som følge av substratoksidasjon, inkludert beregning av mitokondrienes relative effektivitet ved å beregne det relative membranpotensialet som genereres per enhet samtidig oksygenfluks. Omdannelsen av ADP til ATP resulterer i en endring i konsentrasjonen av magnesium i reaksjonskammeret, på grunn av forskjellige affiniteter av adenylatene for magnesium. Derfor kan magnesiumgrønn brukes til å måle hastigheten på ATP-syntese, noe som tillater videre beregning av oksidativ fosforyleringseffektivitet (forholdet mellom fosforylering og oksidasjon [P / O]). Endelig tillater bruken av Amplex UltraRed, som produserer et fluorescerende produkt (resorufin) i kombinasjon med hydrogenperoksid, kvantifisering av reaktiv oksygenartsproduksjon under mitokondriell respirasjon, samt forholdet mellom ROS-produksjon og samtidig respirasjon. Disse teknikkene tillater robust kvantifisering av mitokondriell fysiologi under en rekke forskjellige simulerte forhold, og kaster dermed lys over bidraget fra denne kritiske cellulære komponenten til både helse og sykdom.

Den foreslåtte referansetilstanden er den for en sunn stillesittende fullblods (ingen økt kondisjon på grunn av obligatorisk trening) og en fersk muskelprøve samlet fra midten av en postural muskel, som inneholder en høy prosentandel av mitokondrierrike type I skjelettmuskelfibre og inkuberes under forhold som tilnærmer hvilemetabolisme (dvs. 38 ° C og pH 7,0). Under disse forholdene kan etterforskeren forvente L-N-verdier på 2,71 ± 0,90, P N-verdier på 62,40 ± 26,22, PN + S-verdier på 9...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle at JoVE.com

High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

Hester har en eksepsjonell aerob treningskapasitet, noe som gjør hesteskjelettmuskulatur til et viktig vev for både studiet av hestetreningsfysiologi og pattedyrs mitokondriefysiologi. Denne artikkelen beskriver teknikker for omfattende vurdering av mitokondriefunksjon i skjelettmuskulatur hos hest.

Høyoppløselig fluorrespirometri av hesteskjelettmuskulatur

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...

Disse protokollene tillater etterforskerne å gå utover bare å måle mitokondrielt oksygenforbruk, og i stedet tillate måling av viktige mitokondrielle sluttprodukter, ATP og reaktive oksygenarter. Den største fordelen med denne teknikken er at etterforskeren kan måle mitokondriell effektivitet ved direkte å sammenligne oksygenforbruket med hastigheten på sluttproduktproduksjonen. Om sluttproduktet er ATP eller reaktivt oksygen.Teknikkene krever svært nøye oppmerksomhet på detaljer, spesielt for å unngå bobler. Enten de er i åndedrettskammeret eller titreringssprøyter, er bobler din fiende fordi de gjør målingene mindre presise. Etter å ha oppnådd skjelettmuskulaturbiopsier.Fyll respirometerkamrene med magnesiumfrie medier og forsegl inkubasjonskammeret. Sett instrumentets inkubasjonstemperatur til 38 grader Celsius for å representere basaltemperaturen til hestens skjelettmuskel. Og sett blandingen av respirasjonsmediet til 750 o / min ved hjelp av en magnetisk røre som snur i bunnen av respirometerkammeret.Deretter slår du av kammerbelysningen for å unngå interferens med fluorescerende sensorer. Aktiver oksygenelektroden med en 800 millivolt polarisasjonsspenning og forsterk det resulterende signalet med en forsterkningsinnstilling på en. Registrer oksygenkonsentrasjonen annethvert sekund og beregn oksygenfluksen som den negative helningen på oksygenmålingen i løpet av de neste 40 sekundene.Kalibrer deretter oksygensensoren ved å la mediet balansere med romluft. Beregn referanseoksygenpartialtrykk basert på barometertrykk målt med høyoppløselig respirometer og standard atmosfærisk oksygenkonsentrasjon. Bruk grønne fluorescerende sensorer for å kvantifisere det fluorescerende signalet fra respirasjonskammeret.Aktiver sensorene ved 400 til 500 millivolt, og det resulterende signalet blir forsterket med en forsterkning på 1 til 1.000. Deretter legger du TMRM til respirasjonskammeret før du legger til mitokondrier og kalibrerer det fluorescerende signalet ved hjelp av en enkel topunktskalibrering av det fluorescerende signalet mot mengden tilsatt fluorofor før tilsetning av mitokondriene. Utfør den endelige kalibreringen av TMRM-signalet etter fullføring av respirometrititreringsprotokollen ved å levere flere titreringer av frakoblingsmiddel inntil det ikke observeres ytterligere økninger i TMRM-fluorescerende signal, noe som indikerer fullstendig kollaps av mitokondriemembranpotensialet.Bruk blå fluorescerende sensorer til å kvantifisere det fluorescerende signalet fra respirasjonskammeret og aktiver disse sensorene for individuelle instrumenter for å fange det forventede signalet innenfor sensorens lineære område. Tilsett åtte mikroliter av to millimolar EDTA til luftveiene for å chelate kationer som vil konkurrere med magnesiumioner for binding til magnesiumgrønn. Deretter tilsettes fire mikroliter av en millimolar magnesiumgrønn til respirasjonskammeret.Kalibrer det rå fluorescerende signalet med 10 x 2 mikroliter sekvensielle titreringer av 100 millimolar magnesiumklorid, slik at ett minutt mellom titreringene stabiliserer det fluorescerende signalet. Bestem ATTP-syntesehastigheten, som er hellingen av konsentrasjonen av ATP over tid gjennom hele protokollen. Bruk grønne fluorescerende sensorer for å kvantifisere det fluorescerende signalet fra respirasjonskammeret.Aktiver sensorene ved 300 til 400 millivolt. Og det resulterende signalet blir forsterket med en forsterkning på 1 til 1.000. Optimaliser spesifikke innstillinger for individuelle instrumenter for å fange det forventede signalet innenfor sensorens lineære område.Før du legger til mitokondriene, utfør det kjemiske oppsettet og den første kalibreringen av Amplex UltraRed Assay. Tilsett 30 mikromol DTPA til chelatkationer som kan forstyrre reaksjonen. Deretter tilsettes superoksiddismutase eller serratusperoksidase og Amplex UltraRed i respirometrikammeret.La det fluorescerende signalet stabilisere seg. Deretter tilsettes 0,2 mikromol hydrogenperoksid to ganger med et gap på fem minutter. Utfør ytterligere topunktskalibreringer gjennom hele analysen for å tillate justering av responsen til analysen ettersom kjemien til respirometrien endres gjennom analysen med den spesifikke timingen av disse kalibreringspunktene etter utprøverens skjønn.Vortex prøven for å opprettholde en jevn prøvesuspensjon og tilsett 15 mikroliter isolert mitokondriesuspensjon til hvert to milliliter inkubasjonskammer slik at resultatene representerer mitokondrieutbyttet på 18, 75 milligram muskel. Før du legger til substrater, må du måle det gjenværende oksygenforbruket og trekke denne verdien fra oksygenforbruksverdiene for hvert trinn i substratets ikke-koblede inhibitortitrering eller SUIT-protokollen etter fullføring. Bruk en generell SUIT som muliggjør den første karakteriseringen av hesteskjelettmuskulaturens mitokondriefunksjon.Start med sekvensielle titreringer av pyruvat, glutamat og malat i hverandre i hvert kammer for å produsere nikotinamid-adenindinukleotid og stimulere ikke-fosforylerende respirasjon støttet av NADH oksidert gjennom kompleks enbasert lekkasje. Deretter legger du til ADP for å stimulere fosforylerende respirasjon gjennom kompleks en fosforylerende respirasjon. Tilsett succinat for å produsere fosforylerende respirasjon ved å kombinere kompleks en og kompleks to fosforylerende respirasjon Tilsett rotenon for å blokkere kompleks en.Den resulterende oksygenfluksen representerer kapasiteten til kompleks to for å støtte mitokondrielt oksygenforbruk ved oksydasjon av succinat alene. Et høyoppløselig respirometrispor av hesteskjelettmuskulatur, mitokondriell respirasjon og relativt membranpotensial er vist. Respirasjonsverdier av mitokondrier inkubert med TMRM er lavere på grunn av en hemmende effekt av den fluoroforen.Mitokondriell respirasjon og ATTP-syntese av hesteskjelettmuskulatur som inneholder en høy prosentandel av mitokondrier rik type en skjelettmuskelfibre og inkubert under forhold som tilnærmer hvilemetabolisme er vist. Respirometri, spor av hesteskjelettmuskulatur, mitokondriell respirasjon og produksjon av hydrogenperoksid er vist. Respirometri med høy oppløsning krever mye tålmodighet.Personen som kjører analysen vil ha mange tidspunkter der de trenger å gjøre en vurdering av om en stabil tilstand er nådd, og neste trinn kan skje. Vi har bare demonstrert en enkelt titreringsprotokoll. Det er dusinvis flere protokoller som kan brukes på samme måte for å løse spesifikke spørsmål angående mitokondriell metabolisme.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Vurdering av kontraktilitet, trettbarhet og Alternans i isolerte skjelettmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-påført skade av Sebrafisk Embryonic skjelettmuskulatur

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Vurdering av kalsium Sparks i Intakt skjelettmuskelfibre

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolering av Intakt Mitokondrier fra Skeletal Muscle av differensialsentrifugering for høy oppløsning respirometri Målinger

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolering og karakterisering av eksosomer fra skjelettmuskulaturfibroblaster

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Bygging av en realistisk, helkropps, tredimensjonal hesteskjelemodell ved hjelp av beregnede tomografidata

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...