Name: high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle
Uploaded: 2023-02-03T14:40:00
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Os autores gostariam de agradecer o generoso apoio da John and Debbie Oxley Endowed Chair for Equine Sports Medicine e da Grayson Jockey Club Research Foundation.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Oklahoma. Quatro geldings Puro-Sangue (17,5 ± 1,3 anos, 593 ± 45 kg) foram utilizados neste estudo para gerar os resultados representativos.
1. Obtenção de espécime de biópsia de músculo esquelético
<ol><li>Obter biópsias de músculo esquelético (seguir técnica estéril) a partir do centro do músculo semitendíneo (ou outro músculo de interesse), usando u...

<ol>
	<li>Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+muscle+approaching+maximal+rates+of+oxygen+utilization.">Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization.</a> Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , (2014).</li><li>Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+can+be+determined+in+individual+cells+from+the+nernstian+distribution+of+cationic+dyes.">Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes.</a> Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).</li><li>Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ADP-ATP+exchange+in+relation+to+mitochondrial+transmembrane+potential+and+oxygen+consumption.">Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).</li><li>Krumschnabel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).</li><li>Lemieux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+is+altered+in+horse+atypical+myopathy.">Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy.</a> Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).</li><li>Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+muscle+mitochondrial+respiratory+capacity+in+Standardbred+racehorses+as+an+aid+to+predicting+exertional+rhabdomyolysis.">Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis.</a> Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).</li><li>Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+fitness+and+mitochondrial+respiratory+capacity+in+horse+skeletal+muscle.">Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).</li><li>Votion, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+mitochondrial+respiratory+function+in+response+to+endurance+training+and+endurance+racing.">Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing.</a> Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).</li><li>Tosi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+capacity+in+horses+suffering+from+polysaccharide+storage+myopathy.">Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).</li><li>Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hyperthermia+and+acidosis+on+equine+skeletal+muscle+mitochondrial+oxygen+consumption.">Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption.</a> Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).</li><li>Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAPID+COMMUNICATION:+Differential+skeletal+muscle+mitochondrial+characteristics+of+weanling+racing-bred+horses1.">RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1.</a> Journal of Animal Science. , (2019).</li><li>White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submaximal+exercise+training+improves+mitochondrial+efficiency+in+the+gluteus+medius+but+not+in+the+triceps+brachii+of+young+equine+athletes.">Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).</li><li>White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+communication:+Dietary+selenium+improves+skeletal+muscle+mitochondrial+biogenesis+in+young+equine+athletes.">Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes.</a> Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).</li><li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+FluoRespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells,+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle,+and+isolated+mitochondria.">High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li><li>Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+mitochondrial+function+in+skeletal+muscle+of+American+American+Quarter+Horses.">Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses.</a> Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).</li><li>Komlodi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mitochondrial+incubation+media+for+measurement+of+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+physiology.">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetic Communications. , (2020).</li><li>Li Puma, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+oxygen+concentration+influences+rates+of+mitochondrial+hydrogen+peroxide+release+from+cardiac+and+skeletal+muscle+preparations.">Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).</li></ol>

A adição de sinais fluorescentes à saída padrão do respirômetro de alta resolução fornece informações valiosas sobre a fisiologia mitocondrial, mas a calibração meticulosa do sinal fluorescente é crítica para dados de qualidade. Os protocolos originais para o uso de MgG sugerem que as curvas de calibração geradas durante o cálculo das constantes de dissociação magnésio-adenilato poderiam ser aplicadas a ensaios subsequentes4; no entanto, o sinal fluorescente do MgG pode não se...

As mitocôndrias das células eucarióticas produzem a maior parte do ATP utilizado pelas células para trabalho e manutenção1. Um passo fundamental na produção mitocondrial de ATP é a conversão de oxigênio em água e, assim, a capacidade metabólica das mitocôndrias e das células associadas é frequentemente quantificada através da medida do consumo de oxigênio2. No entanto, a fisiologia mitocondrial é mais complexa do que o simples processo de consumo de oxigênio, e a confiança nesse desfecho fornece exclusivamente uma avaliação incompleta do impacto da função e disfunção mitocondrial na saúde celular. A caracterização completa da função mitocondrial requer a avaliação não só do consumo de oxigênio, mas também da produção de ATP, bem como de espécies reativas de oxigênio (EROs).
Medidas adicionais das principais funções mitocondriais podem ser realizadas simultaneamente com a medição da respiração através do uso de fluoróforos específicos. O éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM) é um fluoróforo catiônico que se acumula na matriz mitocondrial em proporção ao potencial de tensão transmembrana mitocondrial, resultando em diminuição da intensidade fluorescente devido a esse acúmulo3. O TMRM pode ser usado como um indicador de mudanças relativas no potencial de membrana mitocondrial, ou pode ser usado para quantificar mudanças precisas na tensão transmembrana com experimentos adicionais para determinar constantes que permitem a conversão do sinal fluorescente em mV. O verde de magnésio (MgG) é um fluoróforo que fluoresce quando ligado ao Mg2+, e é usado para medidas de síntese de ATP com base na afinidade diferencial de ADP e ATP para cátion divalente de magnésio4. Os investigadores devem determinar as constantes específicas de afinidade/dissociação (Kd) para ADP e ATP sob condições analíticas específicas para converter as mudanças na fluorescência de MgG em uma mudança na concentração de ATP. O Amplex UltraRed (AmR) é o fluoróforo utilizado para medir a produção de peróxido de hidrogênio e outras ERO durante a respiração mitocondrial5. A reação entre H 2O2 e AmR (que é catalisada pela peroxidase de raiz forte) produz resorufina, que é detectável através de fluorescência a 530 nM. Cada um desses ensaios pode ser adicionado individualmente a ensaios de respiração mitocondrial em tempo real, para fornecer medidas simultâneas dos respectivos aspectos da fisiologia mitocondrial, fornecendo assim uma ligação direta entre a respiração e a produção mitocondrial.
Os cavalos são capazes de taxas muito altas de consumo de oxigênio específico em massa, devido, em parte, ao conteúdo mitocondrial muito alto do músculo esquelético equino, tornando este tecido altamente relevante para o estudo da fisiologia mitocondrial. Com o desenvolvimento da respirometria de alta resolução, estudos utilizando essa nova tecnologia têm ajudado a definir as contribuições das mitocôndrias do músculo esquelético equino tanto para a notável capacidade de exercício de equinos quanto para a fisiopatologia das doenças do músculo esquelético 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Estudos da função mitocondrial do músculo esquelético equino são particularmente vantajosos, uma vez que a obtenção de grandes quantidades desse tecido é não-terminal. Assim, indivíduos equinos podem não apenas fornecer tecido suficiente para a caracterização completa da função mitocondrial, mas também servir como controles longitudinais para estudos mecanísticos de alta qualidade sobre a fisiologia mitocondrial. Por esta razão, ensaios adicionais para quantificar o potencial de membrana mitocondrial, a síntese de ATP e a produção de ERO que complementam a medida do consumo de oxigênio neste tecido têm sido desenvolvidos, a fim de fornecer uma caracterização mais robusta da fisiologia mitocondrial no músculo esquelético equino.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A5285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab 7.0</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software to operate O2K fluororespirometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>516813</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M3733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial isolation kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>MITOISO1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K fluororespirometer</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium lactobionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxide dismutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration pump</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration syringes</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T5428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCH biopsy needle</td>
			<td>Millenium Surgical Corp</td>
			<td>72-238067</td>
			<td>Available in a range of sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle

A função mitocondrial - fosforilação oxidativa e geração de espécies reativas de oxigênio - é crítica tanto na saúde quanto na doença. Assim, a mensuração da função mitocondrial é fundamental na pesquisa biomédica. O músculo esquelético é uma fonte robusta de mitocôndrias, particularmente em animais com uma capacidade aeróbica muito alta, como cavalos, tornando-os sujeitos ideais para o estudo da fisiologia mitocondrial. Este artigo demonstra o uso da respirometria de alta resolução com fluorometria concorrente, com mitocôndrias de músculo esquelético recém-colhidas, para quantificar a capacidade de oxidar substratos sob diferentes estados mitocondriais e determinar as capacidades relativas de distintos elementos da respiração mitocondrial. O éster metílico de tetrametilrodamina é usado para demonstrar a produção de potencial de membrana mitocondrial resultante da oxidação do substrato, incluindo o cálculo da eficiência relativa da mitocôndria através do cálculo do potencial de membrana relativo gerado por unidade de fluxo simultâneo de oxigênio. A conversão de ADP em ATP resulta em uma mudança na concentração de magnésio na câmara de reação, devido às diferentes afinidades dos adenilatos pelo magnésio. Portanto, o verde de magnésio pode ser usado para medir a taxa de síntese de ATP, permitindo o cálculo adicional da eficiência de fosforilação oxidativa (razão entre fosforilação e oxidação [P/O]). Finalmente, o uso do Amplex UltraRed, que produz um produto fluorescente (resorufina) quando combinado com peróxido de hidrogênio, permite a quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio durante a respiração mitocondrial, bem como a relação entre a produção de ERO e a respiração concomitante. Essas técnicas permitem a quantificação robusta da fisiologia mitocondrial sob uma variedade de diferentes condições simuladas, esclarecendo a contribuição deste componente celular crítico para a saúde e a doença.

O estado de referência proposto é o de um puro-sangue sedentário saudável (sem aumento da aptidão devido ao exercício obrigatório) e uma amostra de músculo fresco coletada do centro de um músculo postural, contendo uma alta porcentagem de fibras musculares esqueléticas tipo I ricas em mitocôndrias e incubadas em condições próximas ao metabolismo de repouso (i.e., 38 °C e pH 7,0). Nessas condições, o examinador pode esperar valores de L N de 2,71 ± 0,90, valores deP N de 62,40 ± 26...

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High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

Os cavalos têm uma excepcional capacidade de exercício aeróbio, tornando o músculo esquelético equino um tecido importante tanto para o estudo da fisiologia do exercício equino quanto para a fisiologia mitocondrial de mamíferos. Este artigo descreve técnicas para a avaliação abrangente da função mitocondrial no músculo esquelético equino.

Fluor-respirometria de alta resolução do músculo esquelético equino

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...

Esses protocolos permitem que os pesquisadores vão além de simplesmente medir o consumo de oxigênio mitocondrial e, em vez disso, permitem a medição dos principais produtos finais mitocondriais, ATP e espécies reativas de oxigênio. A principal vantagem dessa técnica é que o investigador pode medir a eficiência mitocondrial comparando diretamente a taxa de consumo de oxigênio com a taxa de produção do produto final. Se o produto final é ATP ou oxigênio reativo.As técnicas exigem muita atenção aos detalhes, principalmente para evitar bolhas. Seja na câmara de respiração ou nas seringas de titulação, as bolhas são inimigas porque tornam as medições menos precisas. Após a obtenção das biópsias do músculo esquelético.Encha as câmaras do respirômetro com meio livre de magnésio e sele a câmara de incubação. Ajuste a temperatura de incubação do instrumento para 38 graus Celsius para representar a temperatura basal do músculo esquelético equino. E ajuste a mistura do meio de respiração para 750 rpm usando uma agitação magnética girando no fundo da câmara do respirômetro.Em seguida, desligue a iluminação da câmara para evitar interferência com sensores fluorescentes. Energize o eletrodo de oxigênio com uma tensão de polarização de 800 milivolts e amplifice o sinal resultante com uma configuração de ganho de um. Registre a concentração de oxigênio a cada dois segundos e calcule o fluxo de oxigênio como a inclinação negativa da medição de oxigênio ao longo dos 40 segundos seguintes.Em seguida, calibre o sensor de oxigênio, permitindo que a mídia se equilibre com o ar ambiente. Calcular a pressão parcial de oxigênio de referência com base na pressão barométrica medida pelo respirômetro de alta resolução e na concentração padrão de oxigênio atmosférico. Use sensores fluorescentes verdes para quantificar o sinal fluorescente da câmara de respiração.Energize os sensores em 400 a 500 milivolts e o sinal resultante é amplificado com um ganho de 1 a 1.000. Em seguida, adicione TMRM à câmara de respiração antes de adicionar mitocôndrias e calibre o sinal fluorescente usando uma calibração simples de dois pontos do sinal fluorescente versus a quantidade de fluoróforo adicionado antes da adição da mitocôndria. Realizar a calibração final do sinal TMRM após a conclusão do protocolo de titulação da respirometria, fornecendo várias titulações de agente desacoplador até que nenhum novo aumento no sinal fluorescente TMRM seja observado indicando o colapso completo do potencial de membrana mitocondrial.Use sensores fluorescentes azuis para quantificar o sinal fluorescente da câmara de respiração e energize esses sensores para instrumentos individuais para capturar o sinal esperado dentro da faixa linear do sensor. Adicione oito microlitros de EDTA de dois milimolares à câmara respiratória para quelar cátions que competiriam com íons de magnésio para se ligarem ao verde de magnésio. Em seguida, adicione quatro microlitros de um milimolar verde de magnésio à câmara de respiração.Calibrar o sinal fluorescente bruto com titulações sequenciais de 10 por 2 microlitros de cloreto de magnésio de 100 milimolares, permitindo um minuto entre as titulações para estabilizar o sinal fluorescente. Determine a taxa de síntese de ATTP que é a inclinação da concentração de ATP ao longo do tempo ao longo do protocolo. Use sensores fluorescentes verdes para quantificar o sinal fluorescente da câmara de respiração.Energize os sensores em 300 a 400 milivolts. E o sinal resultante é amplificado com um ganho de 1 para 1.000. Otimize configurações específicas para instrumentos individuais para capturar o sinal esperado dentro da faixa linear do sensor.Antes de adicionar as mitocôndrias realize a configuração química e calibração inicial do Amplex UltraRed Assay. Adicionar 30 micromoles de DTPA aos cátions quelados que possam interferir com a reação. Em seguida, adicione superóxido dismutase ou serratus peroxidase e Amplex UltraRed na câmara de respirometria.Deixe o sinal fluorescente estabilizar. Em seguida, adicione 0,2 micromoles de peróxido de hidrogênio duas vezes com um intervalo de cinco minutos. Realizar calibrações adicionais de dois pontos ao longo do ensaio para permitir o ajuste da capacidade de resposta do ensaio à medida que a química da respirometria muda ao longo do ensaio com o tempo específico desses pontos de calibração a critério do investigador.Vórtice a amostra para manter uma suspensão uniforme da amostra e adicionar 15 microlitros de suspensão mitocondrial isolada a cada câmara de incubação de dois mililitros para que os resultados representem o rendimento mitocondrial de 18,75 miligramas de músculo. Antes de adicionar qualquer substrato, meça o consumo residual de oxigênio e subtraia esse valor dos valores de consumo de oxigênio de cada etapa da titulação do inibidor desacoplado do substrato ou do protocolo SUIT após o preenchimento. Utilizar um SUIT de uso geral que permita a caracterização inicial da função mitocondrial do músculo esquelético equino.Comece com titulações sequenciais de piruvato, glutamato e malato uns nos outros em cada câmara para produzir nicotinamida adenina dinucleotídeo e estimular a respiração não fosforilante suportada por NADH oxidado através de vazamento complexo de uma base. Em seguida, adicione ADP para estimular a respiração fosforilante através da respiração fosforilante complexa. Adicione succinato para produzir respiração fosforilante combinando respiração fosforilante complexa um e respiração fosforilante complexa dois Adicione rotenona para bloquear o complexo um.O fluxo de oxigênio resultante representa a capacidade do complexo dois de suportar o consumo de oxigênio mitocondrial pela oxidação isolada do succinato. Um traço respiratório de alta resolução da respiração mitocondrial do músculo esquelético equino e do potencial relativo de membrana é mostrado. Os valores respiratórios das mitocôndrias incubadas com TMRM são menores devido a um efeito inibitório desse fluoróforo.A respiração mitocondrial e a síntese de ATTP do músculo esquelético equino contendo uma alta porcentagem de fibras musculares esqueléticas tipo um ricas em mitocôndrias e incubadas sob condições que aproximam o metabolismo de repouso são mostradas. O traço respiratório da respiração mitocondrial do músculo esquelético equino e a produção de peróxido de hidrogênio são mostrados. A respirometria de alta resolução requer muita paciência.A pessoa que executa o ensaio terá vários pontos de tempo em que precisa fazer uma chamada de julgamento sobre se um estado estacionário foi alcançado e o próximo passo pode ocorrer. Demonstramos apenas um único protocolo de titulação. Existem dezenas de outros protocolos que podem ser aplicados da mesma forma para abordar questões específicas sobre o metabolismo mitocondrial.

Research

JoVE Journal

Biology

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Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedimentos para Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriedades contrátil do músculo esquelético

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-infligido Lesão de Zebrafish muscular esquelético embrionário

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Avaliação do cálcio Faíscas intactas fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolamento de mitocôndrias intactas de Músculo Esquelético por centrifugação diferencial para medições Respirometria de alta resolução

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolamento e Caracterização de Exossomos de Fibroblastos de Músculo Esquelético

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Construção de um modelo esquelético equino realista, de corpo inteiro e tridimensional usando dados de tomografia computadorizada

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...