Name: high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle
Uploaded: 2023-02-03T14:40:00
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Los autores desean agradecer el generoso apoyo de la Cátedra John y Debbie Oxley para Medicina Deportiva Equina y la Fundación de Investigación del Jockey Club Grayson.

Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Oklahoma. En este estudio se utilizaron cuatro pura sangre (17,5 ± 1,3 años, 593 ± 45 kg) para generar los resultados representativos.
1. Obtención de una muestra de biopsia del músculo esquelético
<ol><li>Obtener biopsias del músculo esquelético (seguir la técnica estéril) del centro del músculo semitendinoso (u otro músculo de interés), utilizando u...

<ol>
	<li>Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+muscle+approaching+maximal+rates+of+oxygen+utilization.">Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization.</a> Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , (2014).</li><li>Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+can+be+determined+in+individual+cells+from+the+nernstian+distribution+of+cationic+dyes.">Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes.</a> Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).</li><li>Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ADP-ATP+exchange+in+relation+to+mitochondrial+transmembrane+potential+and+oxygen+consumption.">Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).</li><li>Krumschnabel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).</li><li>Lemieux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+is+altered+in+horse+atypical+myopathy.">Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy.</a> Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).</li><li>Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+muscle+mitochondrial+respiratory+capacity+in+Standardbred+racehorses+as+an+aid+to+predicting+exertional+rhabdomyolysis.">Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis.</a> Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).</li><li>Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+fitness+and+mitochondrial+respiratory+capacity+in+horse+skeletal+muscle.">Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).</li><li>Votion, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+mitochondrial+respiratory+function+in+response+to+endurance+training+and+endurance+racing.">Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing.</a> Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).</li><li>Tosi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+capacity+in+horses+suffering+from+polysaccharide+storage+myopathy.">Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).</li><li>Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hyperthermia+and+acidosis+on+equine+skeletal+muscle+mitochondrial+oxygen+consumption.">Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption.</a> Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).</li><li>Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAPID+COMMUNICATION:+Differential+skeletal+muscle+mitochondrial+characteristics+of+weanling+racing-bred+horses1.">RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1.</a> Journal of Animal Science. , (2019).</li><li>White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submaximal+exercise+training+improves+mitochondrial+efficiency+in+the+gluteus+medius+but+not+in+the+triceps+brachii+of+young+equine+athletes.">Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).</li><li>White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+communication:+Dietary+selenium+improves+skeletal+muscle+mitochondrial+biogenesis+in+young+equine+athletes.">Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes.</a> Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).</li><li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+FluoRespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells,+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle,+and+isolated+mitochondria.">High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li><li>Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+mitochondrial+function+in+skeletal+muscle+of+American+American+Quarter+Horses.">Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses.</a> Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).</li><li>Komlodi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mitochondrial+incubation+media+for+measurement+of+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+physiology.">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetic Communications. , (2020).</li><li>Li Puma, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+oxygen+concentration+influences+rates+of+mitochondrial+hydrogen+peroxide+release+from+cardiac+and+skeletal+muscle+preparations.">Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).</li></ol>

La adición de señales fluorescentes a la salida estándar del respirómetro de alta resolución proporciona información valiosa sobre la fisiología mitocondrial, pero la calibración meticulosa de la señal fluorescente es fundamental para los datos de calidad. Los protocolos originales para el uso de MgG sugieren que las curvas de calibración generadas al calcular las constantes de disociación magnesio-adenilato podrían aplicarse a ensayos posteriores4; sin embargo, la señal fluorescente ...

Las mitocondrias de las células eucariotas producen la mayor parte del ATP utilizado por las células para el trabajo y el mantenimiento1. Un paso clave en la producción mitocondrial de ATP es la conversión de oxígeno en agua, y por lo tanto la capacidad metabólica de las mitocondrias y las células asociadas se cuantifica con frecuencia a través de la medición del consumo de oxígeno2. Sin embargo, la fisiología mitocondrial es más compleja que el simple proceso de consumo de oxígeno, y la dependencia de este criterio de valoración proporciona exclusivamente una evaluación incompleta del impacto de la función mitocondrial y la disfunción en la salud celular. La caracterización completa de la función mitocondrial requiere la evaluación no solo del consumo de oxígeno, sino también de la producción de ATP y de especies reactivas de oxígeno (ROS).
Se pueden lograr medidas adicionales de las funciones mitocondriales clave simultáneamente con la medición de la respiración mediante el uso de fluoróforos específicos. El éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM) es un fluoróforo catiónico que se acumula en la matriz mitocondrial en proporción al potencial de voltaje transmembrana mitocondrial, lo que resulta en una disminución de la intensidad fluorescente debido a esta acumulación3. TMRM se puede utilizar como un indicador de cambios relativos en el potencial de la membrana mitocondrial, o se puede utilizar para cuantificar cambios precisos en el voltaje transmembrana con experimentos adicionales para determinar constantes que permiten la conversión de la señal fluorescente a mV. El verde de magnesio (MgG) es un fluoróforo que emite fluorescencia cuando se une a Mg2+, y se utiliza para mediciones de la síntesis de ATP basadas en la afinidad diferencial de ADP y ATP para el catión divalente de magnesio4. Los investigadores deben determinar las constantes específicas de afinidad/disociación (Kd) tanto para ADP como para ATP bajo condiciones analíticas específicas para convertir los cambios en la fluorescencia de MgG en un cambio en la concentración de ATP. Amplex UltraRed (AmR) es el fluoróforo utilizado para medir la producción de peróxido de hidrógeno y otras ROS durante la respiración mitocondrial5. La reacción entreH2O2y AmR (que es catalizada por la peroxidasa de rábano picante) produce resorufina, que es detectable a través de la fluorescencia a 530 nM. Cada uno de estos ensayos se puede agregar individualmente a los ensayos de respiración mitocondrial en tiempo real, para proporcionar mediciones concurrentes de los aspectos respectivos de la fisiología mitocondrial, proporcionando así un vínculo directo entre la respiración y la producción mitocondrial.
Los caballos son capaces de tasas muy altas de consumo de oxígeno específico de masa, debido en parte al alto contenido mitocondrial del músculo esquelético equino, lo que hace que este tejido sea muy relevante para estudiar la fisiología mitocondrial. Con el desarrollo de la respirometría de alta resolución, los estudios que utilizan esta nueva tecnología han ayudado a definir las contribuciones de las mitocondrias del músculo esquelético equino tanto a la notable capacidad de ejercicio de los caballos como a la fisiopatología de las enfermedades del músculo esquelético 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Los estudios de la función mitocondrial del músculo esquelético equino son particularmente ventajosos, ya que la obtención de grandes cantidades de este tejido no es terminal. Por lo tanto, los sujetos equinos no solo pueden proporcionar suficiente tejido para la caracterización completa de la función mitocondrial, sino que también sirven como controles longitudinales para estudios mecanicistas de alta calidad sobre la fisiología mitocondrial. Por esta razón, se han desarrollado ensayos adicionales para cuantificar el potencial de membrana mitocondrial, la síntesis de ATP y la producción de ROS que complementan la medición del consumo de oxígeno en este tejido, con el fin de proporcionar una caracterización más robusta de la fisiología mitocondrial en el músculo esquelético equino.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A5285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab 7.0</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software to operate O2K fluororespirometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>516813</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M3733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial isolation kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>MITOISO1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K fluororespirometer</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium lactobionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxide dismutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration pump</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration syringes</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T5428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCH biopsy needle</td>
			<td>Millenium Surgical Corp</td>
			<td>72-238067</td>
			<td>Available in a range of sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle

La función mitocondrial (fosforilación oxidativa y generación de especies reactivas de oxígeno) es crítica tanto en la salud como en la enfermedad. Por lo tanto, la medición de la función mitocondrial es fundamental en la investigación biomédica. El músculo esquelético es una fuente robusta de mitocondrias, particularmente en animales con una capacidad aeróbica muy alta, como los caballos, lo que los convierte en sujetos ideales para estudiar la fisiología mitocondrial. Este artículo demuestra el uso de respirometría de alta resolución con fluorometría concurrente, con mitocondrias del músculo esquelético recién cosechadas, para cuantificar la capacidad de oxidar sustratos bajo diferentes estados mitocondriales y determinar las capacidades relativas de distintos elementos de la respiración mitocondrial. El éster metílico de tetrametilrodamina se utiliza para demostrar la producción del potencial de membrana mitocondrial resultante de la oxidación del sustrato, incluido el cálculo de la eficiencia relativa de las mitocondrias mediante el cálculo del potencial relativo de membrana generado por unidad de flujo de oxígeno concurrente. La conversión de ADP a ATP resulta en un cambio en la concentración de magnesio en la cámara de reacción, debido a las diferentes afinidades de los adenilatos para el magnesio. Por lo tanto, el verde de magnesio se puede utilizar para medir la tasa de síntesis de ATP, lo que permite el cálculo adicional de la eficiencia de la fosforilación oxidativa (relación entre la fosforilación y la oxidación [P / O]). Finalmente, el uso de Amplex UltraRed, que produce un producto fluorescente (resorufina) cuando se combina con peróxido de hidrógeno, permite la cuantificación de la producción de especies reactivas de oxígeno durante la respiración mitocondrial, así como la relación entre la producción de ROS y la respiración concurrente. Estas técnicas permiten la cuantificación robusta de la fisiología mitocondrial bajo una variedad de diferentes condiciones simuladas, arrojando así luz sobre la contribución de este componente celular crítico tanto a la salud como a la enfermedad.

El estado de referencia propuesto es el de un pura sangre sedentario sano (sin aumento de la condición física debido al ejercicio obligatorio) y una muestra de músculo fresco recolectada del centro de un músculo postural, que contiene un alto porcentaje de fibras musculares esqueléticas tipo I ricas en mitocondrias e incubadas en condiciones que se aproximan al metabolismo en reposo (es decir, 38 ° C y pH 7.0). En estas condiciones, el investigador puede esperar valores de L N de 2.71 ± 0.90, valores de...

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High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

Los caballos tienen una capacidad excepcional de ejercicio aeróbico, lo que hace que el músculo esquelético equino sea un tejido importante tanto para el estudio de la fisiología del ejercicio equino como para la fisiología mitocondrial de los mamíferos. Este artículo describe técnicas para la evaluación integral de la función mitocondrial en el músculo esquelético equino.

Fluoro-respirometría de alta resolución del músculo esquelético equino

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...

Estos protocolos permiten a los investigadores ir más allá de la simple medición del consumo de oxígeno mitocondrial, y en su lugar permiten la medición de productos finales mitocondriales clave, ATP y especies reactivas de oxígeno. La principal ventaja de esta técnica es que el investigador puede medir la eficiencia mitocondrial comparando directamente la tasa de consumo de oxígeno con la tasa de producción del producto final. Si el producto final es ATP u oxígeno reactivo.Las técnicas requieren una atención muy cuidadosa a los detalles, particularmente para evitar burbujas. Ya sea que estén en la cámara de respiración o en las jeringas de titulación, las burbujas son su enemigo porque hacen que las mediciones sean menos precisas. Después de obtener las biopsias del músculo esquelético.Llene las cámaras del respirómetro con medios libres de magnesio y selle la cámara de incubación. Ajuste la temperatura de incubación del instrumento a 38 grados centígrados para representar la temperatura basal del músculo esquelético equino. Y ajuste la mezcla de los medios respiratorios a 750 rpm usando un movimiento magnético girando en la parte inferior de la cámara del respirómetro.A continuación, apague la iluminación de la cámara para evitar interferencias con los sensores fluorescentes. Energize el electrodo de oxígeno con un voltaje de polarización de 800 milivoltios y amplifique la señal resultante con un ajuste de ganancia de uno. Registre la concentración de oxígeno cada dos segundos y calcule el flujo de oxígeno como la pendiente negativa de la medición de oxígeno durante los 40 segundos siguientes.Luego calibre el sensor de oxígeno permitiendo que el medio se equilibre con el aire ambiente. Calcular la presión parcial de oxígeno de referencia basada en la presión barométrica medida por el respirómetro de alta resolución y la concentración estándar de oxígeno atmosférico. Utilice sensores fluorescentes verdes para cuantificar la señal fluorescente de la cámara de respiración.Energize los sensores a 400 a 500 milivoltios y la señal resultante se amplifica con una ganancia de 1 a 1, 000. A continuación, agregue TMRM a la cámara de respiración antes de agregar mitocondrias y calibre la señal fluorescente utilizando una calibración simple de dos puntos de la señal fluorescente frente a la cantidad de fluoróforo agregado antes de la adición de las mitocondrias. Realizar la calibración final de la señal TMRM después de completar el protocolo de titulación de respirometría mediante la entrega de varias valoraciones del agente de desacoplamiento hasta que no se observen aumentos adicionales en la señal fluorescente TMRM que indiquen el colapso completo del potencial de la membrana mitocondrial.Utilice sensores fluorescentes azules para cuantificar la señal fluorescente de la cámara de respiración y energizar estos sensores para que los instrumentos individuales capturen la señal esperada dentro del rango lineal del sensor. Agregue ocho microlitros de dos milimolares EDTA a la cámara respiratoria para quelar cationes que competirían con los iones de magnesio para unirse al verde de magnesio. Luego, agregue cuatro microlitros de un verde de magnesio milimolar a la cámara de respiración.Calibre la señal fluorescente cruda con valoraciones secuenciales de 10 por 2 microlitros de cloruro de magnesio milimolar, permitiendo un minuto entre valoraciones para estabilizar la señal fluorescente. Determine la tasa de síntesis de ATTP, que es la pendiente de la concentración de ATP a lo largo del tiempo a lo largo del protocolo. Utilice sensores fluorescentes verdes para cuantificar la señal fluorescente de la cámara de respiración.Energize los sensores a 300 a 400 milivoltios. Y la señal resultante se amplifica con una ganancia de 1 a 1, 000. Optimice los ajustes específicos de instrumentos individuales para capturar la señal esperada dentro del rango lineal del sensor.Antes de agregar las mitocondrias, realice la configuración química y la calibración inicial del ensayo Amplex UltraRed. Agregue 30 micromoles de DTPA para quelar cationes que puedan interferir con la reacción. Luego agregue superóxido dismutasa o serratus peroxidasa y Amplex UltraRed en la cámara de respirometría.Permita que la señal fluorescente se estabilice. Luego agregue 0.2 micromoles de peróxido de hidrógeno dos veces con un espacio de cinco minutos. Realice calibraciones adicionales de dos puntos a lo largo del ensayo para permitir el ajuste de la capacidad de respuesta del ensayo a medida que la química de la respirometría cambia a lo largo del ensayo con el tiempo específico de estos puntos de calibración a discreción del investigador.Vortex la muestra para mantener una suspensión de muestra uniforme y agregar 15 microlitros de suspensión mitocondrial aislada a cada cámara de incubación de dos mililitros para que los resultados representen el rendimiento mitocondrial de 18.75 miligramos de músculo. Antes de agregar cualquier sustrato, mida el consumo de oxígeno residual y reste este valor de los valores de consumo de oxígeno de cada paso en la titulación del inhibidor desacoplado del sustrato o el protocolo SUIT después de la finalización. Utilice un SUIT de propósito general que permita la caracterización inicial de la función mitocondrial del músculo esquelético equino.Comience con titulaciones secuenciales de piruvato, glutamato y malato entre sí en cada cámara para producir nicotinamida adenina dinucleótido y estimular la respiración no fosforilante apoyada por NADH oxidado a través de una fuga compleja de una sola base. Luego agregue ADP para estimular la respiración fosforilante a través de la respiración fosforilante compleja uno. Agregue succinato para producir respiración fosforilante combinando la respiración fosforilante del complejo uno y el complejo dos Agregue rotenona para bloquear el complejo uno.El flujo de oxígeno resultante representa la capacidad del complejo dos para apoyar el consumo de oxígeno mitocondrial por la oxidación del succinato solo. Se muestra un rastro de respirometría de alta resolución de la respiración mitocondrial del músculo esquelético equino y el potencial relativo de la membrana. Los valores respiratorios de las mitocondrias incubadas con TMRM son más bajos debido a un efecto inhibitorio de ese fluoróforo.Se muestra la respiración mitocondrial y la síntesis de ATTP del músculo esquelético equino que contiene un alto porcentaje de fibras musculares esqueléticas tipo uno ricas en mitocondrias e incubadas en condiciones que se aproximan al metabolismo en reposo. Se muestra el rastro de respirometría de la respiración mitocondrial del músculo esquelético equino y la producción de peróxido de hidrógeno. La respirometría de alta resolución requiere mucha paciencia.La persona que ejecuta el ensayo tendrá numerosos puntos de tiempo en los que necesita hacer una llamada de juicio con respecto a si se ha alcanzado un estado estacionario y puede ocurrir el siguiente paso. Solo hemos demostrado un único protocolo de valoración. Hay docenas de protocolos más que se pueden aplicar de la misma manera para abordar preguntas específicas sobre el metabolismo mitocondrial.

Research

JoVE Journal

Biology

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Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

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Investigación

Biología

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Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Evaluación ex vivo de la contractilidad, fatigabilidad y alternancia en aislados músculos esqueléticos

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-infligido lesiones de músculo esquelético embrionario de pez cebra

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Evaluación de calcio en Sparks intactas las fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Aislamiento de mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial para Medidas respirometría de alta resolución

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Construcción de un modelo esquelético equino tridimensional realista, de cuerpo entero utilizando datos de tomografía computarizada

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...