Name: high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle
Uploaded: 2023-02-03T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle at JoVE.com

Yazarlar, John ve Debbie Oxley Atçılık Spor Hekimliği Kürsüsü ve Grayson Jokey Kulübü Araştırma Vakfı'nın cömert desteğini kabul etmek istiyor.

Bu çalışma Oklahoma Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada temsili sonuçları üretmek için dört safkan jel (17.5 ± 1.3 yıl, 593 ± 45 kg) kullanılmıştır.
1. İskelet kası biyopsi örneğinin alınması
<ol><li>Hafif sedasyon altındayken 12 G University College Hospital (UCH) biyopsi iğnesi (bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak ve daha önce yayınlanmış bir raporu...

<ol>
	<li>Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+muscle+approaching+maximal+rates+of+oxygen+utilization.">Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization.</a> Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , (2014).</li><li>Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+can+be+determined+in+individual+cells+from+the+nernstian+distribution+of+cationic+dyes.">Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes.</a> Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).</li><li>Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ADP-ATP+exchange+in+relation+to+mitochondrial+transmembrane+potential+and+oxygen+consumption.">Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).</li><li>Krumschnabel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).</li><li>Lemieux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+is+altered+in+horse+atypical+myopathy.">Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy.</a> Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).</li><li>Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+muscle+mitochondrial+respiratory+capacity+in+Standardbred+racehorses+as+an+aid+to+predicting+exertional+rhabdomyolysis.">Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis.</a> Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).</li><li>Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+fitness+and+mitochondrial+respiratory+capacity+in+horse+skeletal+muscle.">Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).</li><li>Votion, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+mitochondrial+respiratory+function+in+response+to+endurance+training+and+endurance+racing.">Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing.</a> Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).</li><li>Tosi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+capacity+in+horses+suffering+from+polysaccharide+storage+myopathy.">Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).</li><li>Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hyperthermia+and+acidosis+on+equine+skeletal+muscle+mitochondrial+oxygen+consumption.">Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption.</a> Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).</li><li>Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAPID+COMMUNICATION:+Differential+skeletal+muscle+mitochondrial+characteristics+of+weanling+racing-bred+horses1.">RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1.</a> Journal of Animal Science. , (2019).</li><li>White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submaximal+exercise+training+improves+mitochondrial+efficiency+in+the+gluteus+medius+but+not+in+the+triceps+brachii+of+young+equine+athletes.">Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).</li><li>White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+communication:+Dietary+selenium+improves+skeletal+muscle+mitochondrial+biogenesis+in+young+equine+athletes.">Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes.</a> Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).</li><li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+FluoRespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells,+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle,+and+isolated+mitochondria.">High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li><li>Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+mitochondrial+function+in+skeletal+muscle+of+American+American+Quarter+Horses.">Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses.</a> Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).</li><li>Komlodi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mitochondrial+incubation+media+for+measurement+of+respiration+and+hydrogen+peroxide+production.">Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+physiology.">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetic Communications. , (2020).</li><li>Li Puma, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+oxygen+concentration+influences+rates+of+mitochondrial+hydrogen+peroxide+release+from+cardiac+and+skeletal+muscle+preparations.">Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).</li></ol>

Yüksek çözünürlüklü respirometrenin standart çıkışına floresan sinyallerin eklenmesi, mitokondriyal fizyoloji hakkında değerli bilgiler sağlar, ancak floresan sinyalinin titiz kalibrasyonu kalite verileri için kritik öneme sahiptir. MgG kullanımı için orijinal protokoller, magnezyum-adenilat ayrışma sabitleri hesaplanırken üretilen kalibrasyon eğrilerinin sonraki tahlillere uygulanabileceğini düşündürmektedir4; Bununla birlikte, MgG'den gelen floresan sinyali, bu yakl...

Ökaryotik hücrelerin mitokondrileri, hücreler tarafından iş ve bakım için kullanılan ATP'nin çoğunu üretir1. ATP'nin mitokondriyal üretiminde önemli bir adım, oksijenin suya dönüştürülmesidir ve bu nedenle mitokondri ve ilişkili hücrelerin metabolik kapasitesi, oksijen tüketiminin ölçülmesiyle sıklıkla ölçülür2. Bununla birlikte, mitokondriyal fizyoloji, basit oksijen tüketimi sürecinden daha karmaşıktır ve bu son noktaya güvenmek, mitokondriyal fonksiyonun ve işlev bozukluğunun hücresel sağlık üzerindeki etkisinin eksik bir değerlendirmesini sağlar. Mitokondriyal fonksiyonun tam karakterizasyonu, sadece oksijen tüketiminin değil, aynı zamanda ATP ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin de değerlendirilmesini gerektirir.
Anahtar mitokondriyal fonksiyonların ek ölçümleri, spesifik floroforların kullanımı yoluyla solunum ölçümü ile eşzamanlı olarak gerçekleştirilebilir. Tetrametilrhodamine methylester (TMRM), mitokondriyal matriste mitokondriyal transmembran voltaj potansiyeli ile orantılı olarak biriken ve bu birikim nedeniyle floresan yoğunluğunda bir azalmaya neden olankatyonik bir florofordur 3. TMRM, mitokondriyal membran potansiyelindeki göreceli değişikliklerin bir göstergesi olarak kullanılabilir veya floresan sinyalinin mV'ye dönüştürülmesine izin veren sabitleri belirlemek için ek deneylerle transmembran voltajındaki hassas değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Magnezyum yeşili (MgG), Mg2 + ile bağlandığında floresan olan bir florofordur ve magnezyum iki değerli katyon4 için ADP ve ATP'nin diferansiyel afinitesine dayanan ATP sentezinin ölçümleri için kullanılır. Araştırmacılar, MgG floresanındaki değişiklikleri ATP konsantrasyonundaki bir değişikliğe dönüştürmek için spesifik analitik koşullar altında hem ADP hem de ATP için spesifik afinite / ayrışma sabitlerini (Kd) belirlemelidir. Amplex UltraRed (AmR), mitokondriyal solunum sırasında hidrojen peroksit ve diğer ROS üretimini ölçmek için kullanılan florofordur5. H2O2ve AmR (yaban turpu peroksidaz tarafından katalize edilen) arasındaki reaksiyon, 530 nM'de floresan yoluyla tespit edilebilen resorufin üretir. Bu testlerin her biri, mitokondriyal fizyolojinin ilgili yönlerinin eşzamanlı ölçümlerini sağlamak için gerçek zamanlı mitokondriyal solunum tahlillerine ayrı ayrı eklenebilir, böylece solunum ve mitokondriyal çıktı arasında doğrudan bir bağlantı sağlanır.
Atlar, kısmen at iskelet kasının çok yüksek mitokondriyal içeriğinden dolayı çok yüksek oranda kütleye özgü oksijen tüketimi yeteneğine sahiptir ve bu dokuyu mitokondriyal fizyolojiyi incelemek için oldukça alakalı hale getirir. Yüksek çözünürlüklü respirometrinin gelişmesiyle birlikte, bu yeni teknolojiyi kullanan çalışmalar, at iskelet kası mitokondrisinin hem atların olağanüstü egzersiz kapasitesine hem de iskelet kası hastalıklarının patofizyolojisine katkılarını tanımlamaya yardımcı olmuştur 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . At iskelet kası mitokondriyal fonksiyonu üzerine yapılan çalışmalar özellikle avantajlıdır, çünkü bu dokunun büyük miktarlarının elde edilmesi terminal değildir. Bu nedenle, at denekleri sadece mitokondriyal fonksiyonun tam karakterizasyonu için yeterli doku sağlamakla kalmaz, aynı zamanda mitokondriyal fizyolojiye yüksek kaliteli, mekanik çalışmalar için uzunlamasına kontroller olarak da hizmet eder. Bu nedenle, at iskelet kasında mitokondriyal fizyolojinin daha sağlam bir karakterizasyonunu sağlamak için mitokondriyal membran potansiyelini, ATP sentezini ve bu dokudaki oksijen tüketiminin ölçümünü tamamlayan ROS üretimini ölçmek için ek testler geliştirilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A5285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab 7.0</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software to operate O2K fluororespirometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>D1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>516813</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M3733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial isolation kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>MITOISO1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K fluororespirometer</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td>Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium lactobionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Must be made fresh daily prior to assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxide dismutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>S8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration pump</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titration syringes</td>
			<td>Oroboros Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td>
			<td>T5428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCH biopsy needle</td>
			<td>Millenium Surgical Corp</td>
			<td>72-238067</td>
			<td>Available in a range of sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle

Mitokondriyal fonksiyon - oksidatif fosforilasyon ve reaktif oksijen türlerinin oluşumu - hem sağlık hem de hastalıkta kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyonun ölçülmesi biyomedikal araştırmalarda esastır. İskelet kası, özellikle atlar gibi çok yüksek aerobik kapasiteye sahip hayvanlarda sağlam bir mitokondri kaynağıdır ve bu da onları mitokondriyal fizyolojiyi incelemek için ideal konular haline getirir. Bu makale, farklı mitokondriyal durumlar altında substratları oksitleme kapasitesini ölçmek ve mitokondriyal solunumun farklı elementlerinin göreceli kapasitelerini belirlemek için eşzamanlı florometri ile yüksek çözünürlüklü respirometrinin kullanımını göstermektedir. Tetrametilrhodamine metilester, eşzamanlı oksijen akışı birimi başına üretilen nispi membran potansiyelini hesaplayarak mitokondrinin nispi verimliliğinin hesaplanması da dahil olmak üzere, substrat oksidasyonundan kaynaklanan mitokondriyal membran potansiyelinin üretimini göstermek için kullanılır. ADP'nin ATP'ye dönüşümü, magnezyum için adenilatların farklı afiniteleri nedeniyle reaksiyon odasındaki magnezyum konsantrasyonunda bir değişikliğe neden olur. Bu nedenle, magnezyum yeşili, ATP sentez hızını ölçmek için kullanılabilir ve oksidatif fosforilasyon verimliliğinin daha fazla hesaplanmasına izin verir (fosforilasyonun oksidasyona oranı [P / O]). Son olarak, hidrojen peroksit ile kombine edildiğinde bir floresan ürün (resorufin) üreten Amplex UltraRed'in kullanımı, mitokondriyal solunum sırasında reaktif oksijen türlerinin üretiminin nicelleştirilmesine ve ROS üretimi ile eşzamanlı solunum arasındaki ilişkiye izin verir. Bu teknikler, mitokondriyal fizyolojinin çeşitli simüle edilmiş koşullar altında sağlam bir şekilde nicelleştirilmesine izin verir, böylece bu kritik hücresel bileşenin hem sağlığa hem de hastalığa katkısına ışık tutar.

Önerilen referans durumu, sağlıklı bir sedanter safkan (zorunlu egzersiz nedeniyle artan zindelik yok) ve postüral kasın merkezinden toplanan, mitokondri bakımından zengin tip I iskelet kası liflerinin yüksek bir yüzdesini içeren ve dinlenme metabolizmasına yaklaşan koşullar altında inkübe edilen taze bir kas örneğidir (yani, 38 ° C ve pH 7.0). Bu koşullar altında, araştırmacı L N değerleri 2.71 ± 0.90, PN değerleri 62.40 ± 26.22, PN+S değerleri 93.67 ± 34.7...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle at JoVE.com

High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

Atlar olağanüstü bir aerobik egzersiz kapasitesine sahiptir, bu da at iskelet kasını hem at egzersiz fizyolojisi hem de memeli mitokondriyal fizyolojisi çalışmaları için önemli bir doku haline getirir. Bu makalede, at iskelet kasında mitokondriyal fonksiyonun kapsamlı değerlendirilmesi için teknikler açıklanmaktadır.

At İskelet Kasının Yüksek Çözünürlüklü Floro-Respirometrisi

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...

Bu protokoller, araştırmacıların mitokondriyal oksijen tüketimini ölçmenin ötesine geçmelerine izin verir ve bunun yerine anahtar mitokondriyal son ürünlerin, ATP'nin ve reaktif oksijen türlerinin ölçülmesine izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacının oksijen tüketim oranını doğrudan son ürün üretim oranıyla karşılaştırarak mitokondriyal verimliliği ölçebilmesidir. Son ürünün ATP mi yoksa reaktif oksijen mi olduğu.Teknikler, özellikle kabarcıklardan kaçınmak için ayrıntılara çok dikkat etmeyi gerektirir. İster solunum odasında ister titrasyon şırıngalarında olsunlar, kabarcıklar düşmanınızdır çünkü ölçümleri daha az hassas hale getirirler. İskelet kası biyopsileri alındıktan sonra.Respirometre odalarını magnezyumsuz ortamlarla doldurun ve inkübasyon odasını kapatın. At iskelet kasının bazal sıcaklığını temsil etmek için alet inkübasyon sıcaklığını 38 santigrat dereceye ayarlayın. Solunum ortamının karıştırılmasını, respirometre odasının dibinde dönen manyetik bir karıştırma kullanarak 750 rpm'ye ayarlayın.Ardından, floresan sensörlerle etkileşimi önlemek için oda aydınlatmasını kapatın. Oksijen elektroduna 800 milivoltluk bir polarizasyon voltajı ile enerji verin ve elde edilen sinyali bir kazanç ayarı ile yükseltin. Oksijen konsantrasyonunu her iki saniyede bir kaydedin ve oksijen akışını, ilerleyen 40 saniye boyunca oksijen ölçümünün negatif eğimi olarak hesaplayın.Ardından, ortamın oda havasıyla dengelenmesine izin vererek oksijen sensörünü kalibre edin. Referans oksijen kısmi basıncını, yüksek çözünürlüklü respirometre ve standart atmosferik oksijen konsantrasyonu ile ölçülen barometrik basınca göre hesaplayın. Solunum odasından gelen floresan sinyalini ölçmek için yeşil floresan sensörleri kullanın.Sensörlere 400 ila 500 milivoltta enerji verin ve elde edilen sinyal 1 ila 1.000 kazançla güçlendirilir. Daha sonra, mitokondri eklemeden önce solunum odasına TMRM ekleyin ve mitokondri ilavesinden önce eklenen florofor miktarına karşı floresan sinyalinin basit iki noktalı kalibrasyonunu kullanarak floresan sinyalini kalibre edin. Respirometri titrasyon protokolünün tamamlanmasından sonra, mitokondriyal membran potansiyelinin tamamen çöktüğünü gösteren TMRM floresan sinyalinde daha fazla artış gözlenmeyene kadar birkaç ayırma maddesi titrasyonu vererek TMRM sinyalinin son kalibrasyonunu gerçekleştirin.Solunum odasından gelen floresan sinyalini ölçmek için mavi floresan sensörleri kullanın ve sensörün doğrusal aralığında beklenen sinyali yakalamak için bu sensörlere ayrı ayrı cihazlar için enerji verin. Magnezyum yeşiline bağlanmak için magnezyum iyonlarıyla rekabet edebilecek katyonları şelatlamak için solunum odasına sekiz mikrolitre iki milimolar EDTA ekleyin. Ardından, solunum odasına dört mikrolitre bir milimolar magnezyum yeşili ekleyin.Ham floresan sinyalini 100 milimolar magnezyum klorürün 10 x 2 mikrolitre sıralı titrasyonlarıyla kalibre ederek flüoresan sinyalini stabilize etmek için titrasyonlar arasında bir dakika bekleyin. Protokol boyunca ATP konsantrasyonunun zaman içindeki eğimi olan ATTP sentez hızını belirleyin. Solunum odasından gelen floresan sinyalini ölçmek için yeşil floresan sensörleri kullanın.Sensörlere 300 ila 400 milivoltta enerji verin. Ve ortaya çıkan sinyal, 1 ila 1.000'lik bir kazançla güçlendirilir. Sensörün lineer aralığında beklenen sinyali yakalamak için her bir cihaz için özel ayarları optimize edin.Mitokondri eklemeden önce, Amplex UltraRed Testinin kimyasal kurulumunu ve ilk kalibrasyonunu gerçekleştirin. Reaksiyona müdahale edebilecek katyonları şelatlamak için 30 mikromol DTPA ekleyin. Daha sonra respirometri odasına süperoksit dismutaz veya serratus peroksidaz ve Amplex UltraRed ekleyin.Floresan sinyalinin dengelenmesine izin verin. Ardından, beş dakikalık bir boşlukla iki kez 0.2 mikromol hidrojen peroksit ekleyin. Respirometrinin kimyası tahlil boyunca değiştikçe, araştırmacının takdirine bağlı olarak bu kalibrasyon noktalarının spesifik zamanlaması ile tahlil boyunca tahlilin tepkisinin ayarlanmasına izin vermek için tahlil boyunca ek iki noktalı kalibrasyonlar gerçekleştirin.Düzgün bir numune süspansiyonunu korumak için numuneyi vorteks edin ve her iki mililitrelik inkübasyon odasına 15 mikrolitre izole mitokondri süspansiyonu ekleyin, böylece sonuçlar 18.75 miligram kasın mitokondriyal verimini temsil eder. Herhangi bir substrat eklemeden önce, artık oksijen tüketimini ölçün ve tamamlandıktan sonra substrat unkuplajlı inhibitör titrasyonundaki veya SUIT protokolündeki her adımın oksijen tüketim değerlerinden bu değeri çıkarın. At iskelet kası mitokondriyal fonksiyonunun ilk karakterizasyonuna izin veren genel amaçlı bir SUIT kullanın.Nikotinamid adenin dinükleotid üretmek ve karmaşık tek bazlı sızıntı yoluyla oksitlenen NADH tarafından desteklenen fosforilasyon olmayan solunumu uyarmak için her bir odaya piruvat, glutamat ve malatın birbirini izleyen ardışık titrasyonları ile başlayın. Daha sonra, karmaşık bir fosforilasyon solunumu yoluyla fosforilasyon solunumunu uyarmak için ADP ekleyin. Kompleks bir ve karmaşık iki fosforilleyici solunumu birleştirerek fosforilasyon solunumu üretmek için süksinat ekleyin Karmaşık olanı bloke etmek için rotenon ekleyin.Ortaya çıkan oksijen akışı, kompleks ikinin, tek başına süksinatın oksidasyonu ile mitokondriyal oksijen tüketimini destekleme kapasitesini temsil eder. At iskelet kası mitokondriyal solunumu ve göreceli membran potansiyelinin yüksek çözünürlüklü respirometri izi gösterilmiştir. TMRM ile inkübe edilen mitokondrinin solunum değerleri, floroforun inhibitör etkisi nedeniyle daha düşüktür.Mitokondriyal solunum ve ATTP sentezi yüksek oranda mitokondri içeren at iskelet kasının zengin tip bir iskelet kası lifi içeren ve istirahat metabolizmasına yaklaşan koşullar altında inkübe edildiği gösterilmiştir. At iskelet kası mitokondriyal solunumu ve hidrojen peroksit üretiminin respirometri izi gösterilmiştir. Yüksek çözünürlüklü respirometri çok sabır gerektirir.Tahlili yürüten kişi, kararlı bir duruma ulaşılıp ulaşılmadığı ve bir sonraki adımın gerçekleşebileceği konusunda bir yargı çağrısı yapması gereken çok sayıda zaman noktasına sahip olacaktır. Yalnızca tek bir titrasyon protokolü gösterdik. Mitokondriyal metabolizma ile ilgili belirli soruları ele almak için aynı şekilde uygulanabilecek düzinelerce daha protokol vardır.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Biyoloji

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Rat Prosedürleri<em&gt; In situ</em&gt; İskelet Kası Kontraktil Özellikleri

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Bilgisayarlı Tomografi Verileri Kullanılarak Gerçekçi, Tüm Vücut, Üç Boyutlu At İskelet Modelinin Yapımı

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...