バイオリアクターを使用して人工多能性幹細胞またはIPSC培養プロトコルを2Dから3Dに変換することで、ハイスループットスクリーニングなどの大規模なアプリケーション向けに多数の細胞を生成できます。生理学的3D環境におけるこの高速神経分化プロトコルは、スターター細胞の相互作用を改善し、バッチ間=バッチ間の変動が少なく、より短い期間で高い細胞収量を提供し、それによってコストと時間を削減します。欧州人工多能性幹細胞銀行は、他の脳細胞や心筋細胞を含む複数の系統にわたる分化細胞を迅速かつ費用効果の高い方法で生成するために同様のアプローチを適用しています。
ヒト誘導多能性幹細胞またはヒトiPS細胞培養が60〜80%コンフルエントになった時点で前培養を開始します。ヒトiPS細胞から培地を完全に吸引し、1X DPBSで細胞を2回穏やかにすすぎます。2ミリリットルの予熱したトリプシンEDTA溶液を6センチメートルのペトリ皿に加え、インキュベーター内で摂氏37度で3分間細胞をインキュベートします。
次に、皿を軽くたたいて細胞の剥離を促進するか、細胞が剥離していない場合は1〜2分長くインキュベートします。次に、ROCK阻害剤を含む5ミリリットルのフィーダーフリーIPSC維持培地を加えて、各ディッシュに細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を15ミリリットルまたは50ミリリットルのチューブに移し、ピペッティングで穏やかに混合して細胞の特異化を確実にします。
自動セルカウンターを使用して100マイクロリットルの細胞懸濁液中の細胞数を決定し、所望の量の細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブに移します。細胞を300 Gで3分間遠心分離します。次に、上清を吸引し、ROCK阻害剤を含む2ミリリットルのフィーダーフリーIPSC維持培地に細胞を再懸濁します。
各50ミリリットルのチューブに18ミリリットルの培地を入れます。次に、20ミリリットルの細胞懸濁液を各バイオリアクターチューブに分注します。チューブをバイオリアクターシステムに入れ、培養パラメータを無制限の期間設定します。
バイオリアクターディスプレイから前培養プログラムを開始します。翌日培地を交換するには、上清を注意深く吸引する前に、骨材をバイオリアクターチューブに約5分間沈降させます。チューブごとにROCK阻害剤を含まない新鮮なフィーダーフリーIPSC維持培地を15ミリリットル追加し、ベンチトップバイオリアクターで24時間培養を続けます。
ニューロンの分化を開始するには、凝集体をバイオリアクターチューブに定着させ、細胞から上清を注意深く吸引し、チューブ内に約5ミリリットルの上清を残します。次に、神経基底培地からなる35ミリリットルの神経誘導培地と、ドキシサイクリン1ミリリットルあたり2マイクログラムを添加する。チューブをベンチトップバイオリアクターに戻し、培養を続けます。
前述のように、メディアの変更を 2 日間毎日実行します。前に示したように上清を吸引した後、凝集体を滅菌済みの15ミリリットルまたは50ミリリットルのチューブに移し、DPBSで凝集体を2回穏やかにすすぎます。凝集体を乱さずにできるだけ慎重に上清を吸引します。
次に、ペレットのサイズに応じて、2〜5ミリリットルの予熱した細胞解離酵素をペレットに加え、水浴中で摂氏37度で約10分間細胞をインキュベートします。凝集体が解離するまで、2分ごとに沈降した骨材を静かに再懸濁します。あらかじめ加温した神経基礎培地を加え、以前に添加した細胞解離酵素の3倍の容量で、細胞を慎重に再懸濁して細胞の特異化を確実にします。
細胞数を決定し、凍結保存用の対応する容量の細胞懸濁液を15ミリリットルまたは50ミリリットルのチューブに移します。細胞を300 Gで3分間遠心分離します。上清を吸引し、10%ジメチルスルホキシドを含む対応する容量の凍結培地に細胞ペレットを静かに再懸濁します。
凍結保存に適したバイアルに細胞懸濁液を分注します。バイアルをすぐに2-プロパノールで満たされた事前に冷却された低速凍結容器に移し、容器を摂氏マイナス80度で一晩置きます。長期保存のために、翌日バイアルを摂氏マイナス150度に置きます。
ヒトiPS細胞の付着培養物を剥離し、単離し、懸濁液に移した後、24時間以内に凝集体が形成され、増殖し続けた。導入遺伝子導入の2日後、初期のニューロンはその後の成熟のために凍結保存することができました。浮遊初期の数日間はヒトiPS細胞の持続的な増殖が観察され、細胞培養数は誘導2日後にピークに達した。
しかし、浮遊状態で4日以上長期間培養しても、凝集体は酵素的単離化に対する耐性が高まったため、細胞収量は改善されませんでした。さらに、ゼロ日目と比較して、骨材径は2日目に50%増加し、5日目にはほぼ2倍になりました。直径が大きくなると凝集体への栄養素供給が制限されますが、細胞の生存率は分化の2日目または5日目には影響を受けませんでした。
ニューロンマーカーβ3チューブリンおよび微小管関連タンパク質(MAP2)の時間的遺伝子発現プロファイルならびに免疫化学的染色により、凍結保存2日目細胞のニューロン細胞同一性が確認された。さらに、神経細胞培養物は微小管関連タンパク質タウ転写物(MAPT)に富み、同時に多能性調節転写因子POU5F1の発現の低下を示し、融解後最初の1週間以内に密な神経突起ネットワークが形成され、これも神経培養の成熟の増加を示唆した。このプロトコルは、大規模で完全に自動化されたバイオリアクターへの変換の基礎を築き、将来の大規模アプリケーションのための細胞出力容量のさらなる大幅な増加を示しています。
ニューロゲニン2で証明されると、分化を促進するための線形決定転写因子の使用は、iPS細胞モデリングを容易にするために多くの異なる細胞タイプおよび疾患に適用されています。
