Bruk av bioreaktorer for å oversette induserte pluripotente stamceller eller IPSC-kulturprotokoller fra 2D til 3D muliggjør generering av celler i høyt antall for store applikasjoner som screening med høy gjennomstrømning. Denne raske nevrondifferensieringsprotokollen i et fysiologisk 3D-miljø forbedrer startcelleinteraksjoner og gir høyt celleutbytte over kortere varighet med lav batch-til=batchvariasjon, og reduserer dermed kostnader og tid. European Bank of Induced Pluripotent Stem Cells bruker lignende tilnærminger for rask og kostnadseffektiv generering av differensierte celler over flere linjer, inkludert andre hjerneceller og kardiomyocytter.
Begynn prekultivering når den menneskeskapte pluripotente stamcellen, eller human iPSC-kultur, er 60 til 80% sammenflytende. Aspirer mediet helt fra de menneskelige iPSCene og skyll forsiktig cellene med 1X DPBS to ganger. Tilsett to milliliter forvarmet trypsin EDTA-løsning til den seks centimeter petriskålen og inkuber cellene i tre minutter ved 37 grader Celsius i en inkubator.
Trykk deretter forsiktig på oppvasken for å lette celleløsningen eller ruge i ett til to minutter lenger hvis cellene ikke blir løsrevet. Deretter resuspenderer du cellene i hver tallerken ved å tilsette fem milliliter materfritt IPSC-vedlikeholdsmedium med ROCK-hemmer. Overfør cellesuspensjonen til et 15 milliliter eller 50 milliliter rør og bland forsiktig ved pipettering for å sikre cellesingularisering.
Bestem cellenumrene i 100 mikroliter cellesuspensjon ved hjelp av en automatisert celleteller og overfør ønsket volum cellesuspensjon til et 50 milliliter rør. Sentrifuge cellene ved 300 G i tre minutter. Deretter aspirerer du supernatanten og resuspenderer cellene i to milliliter materfritt IPSC-vedlikeholdsmedium med ROCK-hemmer.
Fyll hvert 50 milliliter rør med 18 ml av mediet. Deretter dispenserer 20 ml cellesuspensjon i hvert bioreaktorrør. Plasser rørene i bioreaktorsystemet og sett dyrkingsparametrene i ubegrenset varighet.
Start fordyrkingsprogrammet via bioreaktordisplayet. For å skifte media neste dag, la aggregatet sette seg i bioreaktorrørene i omtrent fem minutter før du forsiktig aspirerer supernatanten. Tilsett 15 ml ferskt materfritt IPSC-vedlikeholdsmedium uten ROCK-hemmer per rør og fortsett dyrkingen i benkbioreaktoren i 24 timer.
For å starte nevrondifferensiering, la aggregatet slå seg ned i bioreaktorrørene og aspirer supernatanten forsiktig fra cellene, og etterlater omtrent fem milliliter supernatant i røret. Deretter tilsettes 35 ml nevralt induksjonsmedium bestående av nevrobasalt medium og to mikrogram per milliliter doksycyklin. Plasser rørene tilbake i benkbioreaktoren og fortsett dyrkingen.
Utfør medieendringer hver dag i to dager, som vist tidligere. Etter å ha aspirert supernatanten som tidligere vist, overfør aggregatene til et sterilt 15 milliliter eller 50 milliliter rør og skyll forsiktig aggregatene to ganger med DPBS. Aspirer supernatanten forsiktig så mye som mulig uten å forstyrre aggregatene.
Deretter tilsettes to til fem milliliter forvarmet celledissosiasjonsenzym til pelleten, avhengig av pelletsstørrelsen, og inkuberer cellene i ca. 10 minutter ved 37 grader Celsius i et vannbad. Forsiktig resuspendere de sedimenterte aggregatene hvert annet minutt til aggregatene dissosieres. Legg til forvarmet nevrobasalt medium, tre ganger volumet av det tidligere tilsatte celledissosiasjonsenzymet, og resuspender cellene nøye for å sikre cellesingularisering.
Bestem cellenumrene og overfør det tilsvarende volumet av cellesuspensjon for kryopreservering til et 15 milliliter eller 50 milliliter rør. Sentrifuge til cellene ved 300 G i tre minutter. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten forsiktig i det tilsvarende volumet av frysemediet som inneholder 10 % dimetylsulfoksid.
Aliquot cellesuspensjonen i egnede hetteglass for kryopreservering. Overfør hetteglassene umiddelbart til en forkjølt, frysebeholder med langsom hastighet fylt med 2-propanol og sett beholderen på minus 80 grader Celsius over natten. Plasser hetteglassene på minus 150 grader Celsius neste dag for langtidsoppbevaring.
Etter at de adherente kulturer av humane iPSCs ble løsrevet, singularisert og overført til suspensjon, dannet aggregater innen 24 timer og fortsatte å vokse. Etter to dager med transgen induksjon kunne tidlige nevroner kryopreserveres for senere modning. Vedvarende proliferasjon av humane iPSCs i løpet av de første dagene med suspensjon ble observert, og cellekulturtallet toppet seg etter to dagers induksjon.
Langvarig dyrking i mer enn fire dager i suspensjon forbedret imidlertid ikke celleutbyttet, da aggregatene ble stadig mer resistente mot enzymatisk singularisering. Videre, sammenlignet med dag null, økte den samlede diameteren med 50% på dag to og nesten doblet på dag fem. Selv om økende diameter begrenser næringstilførselen til aggregatene, ble cellens levedyktighet ikke påvirket på dag to eller fem av differensiering.
Den temporale genuttrykksprofilen samt immunokjemisk farging for nevronmarkørene beta tre tubulin og mikrotubuli-assosiert protein, eller MAP2, bekreftet nevroncelleidentiteten til dagens to kryopreserverte celler. I tillegg ble nevronkulturer beriket i mikrotubuli-assosiert protein tau-transkripter, eller MAPT, og viste en samtidig nedgang i uttrykket av pluripotensregulerende transkripsjonsfaktor POU5F1 Et tett nevrittisk nettverk ble dannet innen den første uken etter tining, noe som også antydet en økende modning av nevronkulturer. Denne protokollen legger grunnlaget for oversettelse til storskala og helautomatiske bioreaktorer, som viser en ytterligere betydelig økning i celleutgangskapasitet for fremtidige storskalaapplikasjoner.
Når det er bevist med neurogenin 2, har bruken av lineære bestemmelsestranskripsjonsfaktorer for å akselerere differensiering blitt brukt på mange forskjellige celletyper og sykdommer for å lette iPSC-modellering.
