Plant callus kultur giver en løsning til nøjagtig, effektiv og hurtig evaluering af metabolisk nedbrydning af xenobiotika i planter. Plant callus-kultur kan udelukke mikrobiom eller svampeinterferens og fotokemisk nedbrydning, forenkle matrixeffekten af intakte planter, standardisere dyrkningsbetingelserne, forkorte behandlingsvarigheden og kræve mindre eksperimentel indsats. Den metode, der foreslås her, kan give indsigt i forskellige organiske forurenende stoffers optagelsesadfærd og metaboliske mekanismer på afgrøder og er nyttig i bestræbelserne på miljørisikovurderinger.
Til at begynde med skal du autoklave alt udstyr og udføre alle operationer i en UV-steriliseret ultraren arbejdsbænk. Steriliser den vernaliserede frøoverflade med 75% ethanol i 20 minutter. Skyl dem med sterilt deioniseret vand tre gange og steriliser dem igen med 20% hydrogenperoxid i 20 minutter.
Efter vask af frøene med steriliseret deioniseret vand seks gange, spire dem aseptisk ved såning på autoklaveret, hormonfrit Murashige og Skoog-medium med pH 5,8 indeholdende 1% agargel og inkuberes ved 26 grader Celsius med 16 timers fotoperiode i 15 dage. Efter 15 dages frøinkubation skæres plantens hypocotyl og cotyledon i små stykker på 0,5 centimeter for at opnå explants. Omdan eksplanterne i en petriskål, der indeholder 15 til 20 ml autoklaveret Murashige og Skoog-medium suppleret med oxymon og phycocyanin, og inkuber i mørke ved 26 grader Celsius i tre til fire uger for at fremkalde callus.
Brug en steril skalpel og tang til at adskille callus med en diameter på ca. en centimeter dannet fra de oprindelige eksplanter. Til behandling opløses 2, 4-dibromphenol i 10 ml aseptisk væske Murashige og Skoog-medium. Derefter tilsættes tre gram adskilt gulerodscallus til den tilberedte 2, 4-dibromphenolopløsning.
Efter tilberedning af substratet i blindprøvekontrol som beskrevet i manuskriptet inkuberes alle kolberne i mørke. For at forberede prøven adskilles callus omhyggeligt fra 2, 3-dibromphenolbehandlings- og kontrolkolberne ved filtrering med 0,45 mikron glasfiberfiltre. Vask callus tre gange med ultrarent vand, før du samler det.
Fryse, tørre al den opsamlede callus og homogenisere 0,2 gram tørret callus med en høj gennemstrømning vævskværn ved 70 hertz i tre minutter. Brug en glasmikrosprøjte til at tilføje 50 mikroliter surrogat deutereret 4-n-nanophenol i den homogeniserede callus og hvirvel i et minut. Tilsæt fem ml af opløsningen indeholdende et lige forhold mellem methanol og vand til spiked callus og sonikere det i 30 minutter for at ekstrahere 2, 4-dibromphenol og metabolitter.
Efter ekstraktion centrifugeres suspensionen ved 8.000 G ved fire grader Celsius i 10 minutter, og supernatanten opsamles ved pipettering. Før ekstraktet gennem hydrofil lipofil afbalanceret fastfaseekstraktion eller HLB-SPE-patron med en strømningshastighed på en milliliter pr. Minut. Analysanderne fortyndes ved at føre seks ml methanol gennem HLB-SPE-cylinderampullen.
Derefter koncentreres det opnåede elueringsmiddel til en milliliter under en mild strøm af nitrogengas til instrumentel analyse. Åbn søjlevarmerdøren til analyse for analyse. Installer derefter den ultraeffektive væskekromatografisøjle ved at forbinde søjleindgangen til injektionsventilen og udløbet til massespektrometerets indløb.
Enden af opløsningsmiddelrørene A og B indsættes i de tilsvarende opløsningsmiddelflasker. Prøvehætteglassene anbringes efter serienummer på de tilsvarende steder i prøvebakkerne, og prøvebakkerne sættes i prøvekammeret igen. I softwarevinduet skal du klikke på Instrument og derefter Indløbsmetode for at redigere betingelserne for væskekromatogrammet.
Vælg MS-metode, og indstil parametrene for massespektrumanalyse. Klik på Filer og derefter Ny for at oprette og navngive databasen. Indlæs eksempelprogrammet oprettet ovenfor ved at vælge MS File efterfulgt af Inlet File og Inject Volume.
Gem databasen i projektets eksempelmappe ved at klikke på Filer og gem. Vælg derefter Kør og Start i hovedsoftwarevinduet, og klik på Hent eksempeldata efterfulgt af OK-knappen i starteksempellisten, der køres for at indsamle data. For at behandle dataene skal du vælge måldatarækken og klikke på kromatogramvinduet for at se MS-scanningskromatogrammet.
I kromatogramvinduet skal du klikke på Skærm efterfulgt af TIC. Når du har klikket på scanningsbølgen DS, skal du tilføje spor og OK for at få dattermassespektrescanningen. Kromatogrammet af 2, 4-dibromphenol-behandlet gulerod callus ekstrakt viste tilstedeværelsen af otte forskellige metabolitter sammenlignet med kontrolprøverne.
Derudover indikerer fraværet af forælder 2, 4-dibromphenoltop fra kromatogrammet den hurtige metabolisme af 2, 4-dibromphenol i gulerodscallus under eksperimentelle betingelser. Desuden førte 2, 4-dibromphenol inkuberet i gulerodscallus til dannelsen af metabolitter ved direkte konjugering med glucose og aminosyrer. Alt udstyr samt Murashige og Skoog-mediet skal autoklaveres for at sikre, at differentieringen og vedligeholdelsen af plantens callus udføres under aseptiske forhold.
Omics-tilgange, der følger denne procedure, gør det muligt at skabe et klart fytotoksisk mekanistisk billede af miljøforurenende stoffer.