Name: elucidating the metabolism of 2,4-dibromophenol in plants
Uploaded: 2023-02-10T12:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (21976160) og Zhejiang Province Public Welfare Technology Application Research Project (LGF21B070006).

1. Differentiering af gulerodscallus
BEMÆRK: Autoklave alt udstyr, der bruges her, og udfør alle operationer i et UV-steriliseret ultrarent arbejdsbord.
<ol><li>Vernaliser frøene ved at nedsænke de ensartede gulerodsfrø (Daucus carota var. sativus) i deioniseret vand ved 4 °C i 16 timer.</li>
	<li>Overfladesteriliser de vernaliserede frø med 75% ethanol i 20 minutter, og skyl derefter tre gange med sterilt deioniseret vand under aseptiske forhold.</li>
	<li>Y...

<ol>
	<li>Chakraborty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baseline+investigation+on+plasticizers,+bisphenol+A,+polycyclic+aromatic+hydrocarbons+and+heavy+metals+in+the+surface+soil+of+the+informal+electronic+waste+recycling+workshops+and+nearby+open+dumpsites+in+Indian+metropolitan+cities.">Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities.</a> Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).</li><li>Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence,+fate+and+environmental+risk+of+anionic+surfactants,+bisphenol+A,+perfluorinated+compounds+and+personal+care+products+in+sludge+stabilization+treatments.">Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments.</a> Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).</li><li>Xu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+and+occurrence+of+bisphenol+A+and+thirteen+structural+analogs+in+soil.">Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil.</a> Chemosphere. 277, 130232 (2021).</li><li>Cai, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+nonylphenol+and+nonylphenol+monoethoxylate+in+soil+and+vegetables+from+vegetable+farms+in+the+Pearl+River+Delta,+South+China.">Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China.</a> Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).</li><li>Wang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Migration+and+health+risks+of+nonylphenol+and+bisphenol+a+in+soil-winter+wheat+systems+with+long-term+reclaimed+water+irrigation.">et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).</li><li>Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isomer-specific+approach+to+endocrine-disrupting+nonylphenol+in+infant+food.">An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).</li><li>Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pesticide+metabolism+in+plants+and+microorganisms.">Pesticide metabolism in plants and microorganisms.</a> Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).</li><li>Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+callus+cultures+to+elucidate+the+metabolism+of+tebuconazole,+flurtamone,+fenhexamid,+and+metalaxyl-M+in+Brassica+napus+L.,+Glycine+max+(L.)+Merr.,+Zea+mays+L.,+and+Triticum+aestivum+L.">Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).</li><li>Macherius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolization+of+the+bacteriostatic+agent+triclosan+in+edible+plants+and+its+consequences+for+plant+uptake+assessment.">Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment.</a> Environmental Science &amp; Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).</li><li>Sun, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+metabolism+of+nonylphenol+in+plants:+Isomer+selectivity+involved+with+direct+conjugation.">Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation.</a> Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).</li><li>Schymanski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry:+communicating+confidence.">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental Science &amp; Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).</li><li>Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Household+dust+as+a+repository+of+chemical+accumulation:+new+insights+from+a+comprehensive+high-resolution+mass+spectrometric+study.">Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study.</a> Environmental Science &amp; Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxylated+PBDEs+and+brominated+phenolic+compounds+in+particulate+matters+emitted+during+recycling+of+waste+printed+circuit+boards+in+a+typical+e-waste+workshop+of+South+China.">Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China.</a> Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).</li><li>de Wit, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+brominated+flame+retardants+in+the+environment.">An overview of brominated flame retardants in the environment.</a> Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).</li><li>Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Uptake+and+Metabolism+of+e,4-Dibromophenol+in+Carrot:+In+Vitro+Enzymatic+Direct+Conjugation.">Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).</li><li>Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+framework+for+identifying+toxic+transformation+products+in+complex+environmental+mixtures.">Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).</li><li>Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontarget+screening+with+high+resolution+mass+spectrometry+in+the+environment:+ready+to+go.">Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go.</a> Environmental Science &amp; Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).</li><li>Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplays+between+the+cell+wall+and+phytohormones+in+interaction+between+plants+and+necrotrophic+pathogens.">Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens.</a> Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+metabolic+pathways+of+2,4,6-tribromophenol+in+rice+plants.">Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).</li><li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+of+tetrabromobisphenol+A+in+pumpkin.">Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).</li></ol>

Denne protokol blev udviklet til effektivt at identificere biotransformation af xenobiotika i planter. Det kritiske trin i denne protokol er kulturen af planten callus. Den sværeste del er differentieringen og vedligeholdelsen af planten callus, fordi planten callus let inficeres og udvikles til plantevæv. Derfor er det vigtigt at sikre, at alt anvendt udstyr er autoklaveret, og alle operationer udføres under aseptiske forhold. Differentieringen og vedligeholdelsen af plantens callus skal ske i mørke for at undgå au...

Et stigende antal organiske forurenende stoffer er blevet smidt ud i miljøet på grund af menneskeskabte aktiviteter 1,2, og jord betragtes som et stort dræn for disse forurenende stoffer 3,4. De forurenende stoffer i jorden kan optages af planter og potentielt overføres til organismer på højere trofisk niveau langs fødekæder ved direkte at trænge ind i menneskekroppen gennem afgrødeforbrug, hvilket fører til utilsigtet eksponering 5,6. Planter udnytter forskellige veje til at metabolisere xenobiotika til afgiftning7; Det er vigtigt at belyse metabolismen af xenobiotika, da det styrer den faktiske skæbne for forurenende stoffer i planter. Da metabolitterne kan udskilles via blade (til atmosfæren) eller rødderne, giver bestemmelse af metabolitterne i de meget tidlige eksponeringsfaser mulighed for at teste et udvidet antal metabolitter8. Undersøgelser, der bruger intakte planter, kræver imidlertid langsigtede eksperimenter og komplekse prøveforberedelsesprotokoller, der kan påvirkes af forskellige faktorer.
Plant callus kulturer er derfor et godt alternativ til at studere metabolismen af xenobiotika i planta, da de i høj grad kan forkorte behandlingstiden. Disse kulturer udelukker mikrobiel interferens og fotokemisk nedbrydning, forenkler matrixeffekten af intakte planter, standardiserer dyrkningsbetingelserne og kræver mindre eksperimentel indsats. Plant callus kulturer er med succes blevet anvendt som en alternativ tilgang i metaboliske undersøgelser af triclosan9, nonylphenol10 og tebuconazol8. Disse undersøgelser viste, at de metaboliske mønstre i calluskulturer lignede dem i intakte planter. Denne undersøgelse foreslår en metode til effektiv og nøjagtig identifikation af metabolitter af xenobiotika i planter uden komplekse og tidskrævende protokoller. Her bruger vi plantecalluskulturer i kombination med massespektrometri med høj opløsning til analyse af metabolitter med lavintensitetssignaler11,12.
Til dette formål blev callussuspensioner af gulerod (Daucus carota var. sativus) udsat for 100 μg/l 2,4-dibromphenol i 120 timer i en ryster ved 130 o/min og 26 °C. 2,4-dibromphenol blev valgt på grund af dets forstyrrende endokrine aktivitet13 og udbredte forekomst i jord14. Metabolitterne blev ekstraheret og analyseret ved massespektrometri med høj opløsning. Den her foreslåede protokol kan undersøge in planta metabolisme af andre typer organiske forbindelser, der kan ioniseres.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4-dichlorophenoxyacetic acid</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>1 mg/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% H2O2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>10011218-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-n-NP, &#62;99%</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-n-NP-d4</td>
			<td>Pointe-Claire</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-benzylaminopurine</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>0.5 mg/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>1269101-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7890A-5975&#160;gas chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQULTY ultra-performance&#160;liquid chromatography</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber glass vials</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial climate incubator</td>
			<td>Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD</td>
			<td>RDN-1000A-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaves</td>
			<td>STIK</td>
			<td>MJ-Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column</td>
			<td>ACQUITY UPLC BEH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-5MS capillary column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40071190-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>SCIENTZ&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-throughput tissue grinder</td>
			<td>SCIENTZ&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrOTOF-QII mass spectrometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MS1922801-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium</td>
			<td>HOPEBIO</td>
			<td>HB8469-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H109658-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen blowing instrument&#160;</td>
			<td>AOSHENG</td>
			<td>MD200-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP isomers, &#62;99%</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB cartridges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>60 mg/3 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>100-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)&#160;</td>
			<td>Shouguang Seed Industry Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking&#160;Incubators</td>
			<td>Shanghai bluepard instruments Co.,ltd.</td>
			<td>THZ-98AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid phase extractor</td>
			<td>AUTO SCIENCE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound machine</td>
			<td>ZKI</td>
			<td>UC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-sterilized ultra-clean workbench</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

elucidating the metabolism of 2,4-dibromophenol in plants

Afgrøder kan i vid udstrækning udsættes for organiske forurenende stoffer, da jord er et stort dræn for forurenende stoffer, der kasseres i miljøet. Dette skaber potentiel menneskelig eksponering gennem indtagelse af forurenende akkumulerede fødevarer. Belysning af optagelsen og metabolismen af xenobiotika i afgrøder er afgørende for vurderingen af risikoen for eksponering via kosten hos mennesker. For sådanne forsøg kræver brugen af intakte planter imidlertid langsigtede eksperimenter og komplekse prøveforberedelsesprotokoller, der kan påvirkes af forskellige faktorer. Plant callus kulturer kombineret med højopløsnings massespektrometri (HRMS) kan give en løsning til nøjagtig og tidsbesparende identifikation af metabolitter af xenobiotika i planter, da det kan undgå interferens fra mikrobielt eller svampemikromiljø, forkorte behandlingsvarigheden og forenkle matrixeffekten af intakte planter. 2,4-dibromphenol, et typisk flammehæmmende og hormonforstyrrende stof, blev valgt som modelstof på grund af dets udbredte forekomst i jorden og dets optagelsespotentiale i planter. Heri blev plantecallus genereret fra asepsisfrø og udsat for sterilt 2,4-dibromphenolholdigt dyrkningsmedium. Resultaterne viste, at otte metabolitter af 2,4-dibromphenol blev identificeret i plantens callusvæv efter 120 timers inkubation. Dette indikerer, at 2,4-dibromphenol hurtigt blev metaboliseret i plantens callusvæv. Således er plantekalluskulturplatformen en effektiv metode til at evaluere optagelsen og metabolismen af xenobiotika i planter.

Protokollens trin er afbildet i figur 1. Efter protokollen sammenlignede vi kromatogrammet af gulerodscallusekstraktet fra 2,4-dibromphenolbehandlingen med kontrollerne og fandt otte forskellige toppe, der er til stede i 2,4-dibromphenolbehandlingen, men fraværende i kontrollerne (figur 2). Dette indikerer, at i alt otte metabolitter af 2,4-dibromphenol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 og M187) blev påvist med succes i den 2,4-dibromphenolbehandlede g...

Watch this Scientific Journal Video about Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants at JoVE.com

Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants

Denne protokol beskriver en enkel og effektiv metode til identifikation af 2,4-dibromphenolmetabolitter i planter.

Belysning af metabolismen af 2,4-dibromphenol i planter

Crops can be extensively exposed to organic pollutants, since soil is a major sink for pollutants discarded into the environment. This creates potential ...

Plant callus kultur giver en løsning til nøjagtig, effektiv og hurtig evaluering af metabolisk nedbrydning af xenobiotika i planter. Plant callus-kultur kan udelukke mikrobiom eller svampeinterferens og fotokemisk nedbrydning, forenkle matrixeffekten af intakte planter, standardisere dyrkningsbetingelserne, forkorte behandlingsvarigheden og kræve mindre eksperimentel indsats. Den metode, der foreslås her, kan give indsigt i forskellige organiske forurenende stoffers optagelsesadfærd og metaboliske mekanismer på afgrøder og er nyttig i bestræbelserne på miljørisikovurderinger.Til at begynde med skal du autoklave alt udstyr og udføre alle operationer i en UV-steriliseret ultraren arbejdsbænk. Steriliser den vernaliserede frøoverflade med 75% ethanol i 20 minutter. Skyl dem med sterilt deioniseret vand tre gange og steriliser dem igen med 20% hydrogenperoxid i 20 minutter.Efter vask af frøene med steriliseret deioniseret vand seks gange, spire dem aseptisk ved såning på autoklaveret, hormonfrit Murashige og Skoog-medium med pH 5,8 indeholdende 1% agargel og inkuberes ved 26 grader Celsius med 16 timers fotoperiode i 15 dage. Efter 15 dages frøinkubation skæres plantens hypocotyl og cotyledon i små stykker på 0,5 centimeter for at opnå explants. Omdan eksplanterne i en petriskål, der indeholder 15 til 20 ml autoklaveret Murashige og Skoog-medium suppleret med oxymon og phycocyanin, og inkuber i mørke ved 26 grader Celsius i tre til fire uger for at fremkalde callus.Brug en steril skalpel og tang til at adskille callus med en diameter på ca. en centimeter dannet fra de oprindelige eksplanter. Til behandling opløses 2, 4-dibromphenol i 10 ml aseptisk væske Murashige og Skoog-medium. Derefter tilsættes tre gram adskilt gulerodscallus til den tilberedte 2, 4-dibromphenolopløsning.Efter tilberedning af substratet i blindprøvekontrol som beskrevet i manuskriptet inkuberes alle kolberne i mørke. For at forberede prøven adskilles callus omhyggeligt fra 2, 3-dibromphenolbehandlings- og kontrolkolberne ved filtrering med 0,45 mikron glasfiberfiltre. Vask callus tre gange med ultrarent vand, før du samler det.Fryse, tørre al den opsamlede callus og homogenisere 0,2 gram tørret callus med en høj gennemstrømning vævskværn ved 70 hertz i tre minutter. Brug en glasmikrosprøjte til at tilføje 50 mikroliter surrogat deutereret 4-n-nanophenol i den homogeniserede callus og hvirvel i et minut. Tilsæt fem ml af opløsningen indeholdende et lige forhold mellem methanol og vand til spiked callus og sonikere det i 30 minutter for at ekstrahere 2, 4-dibromphenol og metabolitter.Efter ekstraktion centrifugeres suspensionen ved 8.000 G ved fire grader Celsius i 10 minutter, og supernatanten opsamles ved pipettering. Før ekstraktet gennem hydrofil lipofil afbalanceret fastfaseekstraktion eller HLB-SPE-patron med en strømningshastighed på en milliliter pr. Minut. Analysanderne fortyndes ved at føre seks ml methanol gennem HLB-SPE-cylinderampullen.Derefter koncentreres det opnåede elueringsmiddel til en milliliter under en mild strøm af nitrogengas til instrumentel analyse. Åbn søjlevarmerdøren til analyse for analyse. Installer derefter den ultraeffektive væskekromatografisøjle ved at forbinde søjleindgangen til injektionsventilen og udløbet til massespektrometerets indløb.Enden af opløsningsmiddelrørene A og B indsættes i de tilsvarende opløsningsmiddelflasker. Prøvehætteglassene anbringes efter serienummer på de tilsvarende steder i prøvebakkerne, og prøvebakkerne sættes i prøvekammeret igen. I softwarevinduet skal du klikke på Instrument og derefter Indløbsmetode for at redigere betingelserne for væskekromatogrammet.Vælg MS-metode, og indstil parametrene for massespektrumanalyse. Klik på Filer og derefter Ny for at oprette og navngive databasen. Indlæs eksempelprogrammet oprettet ovenfor ved at vælge MS File efterfulgt af Inlet File og Inject Volume.Gem databasen i projektets eksempelmappe ved at klikke på Filer og gem. Vælg derefter Kør og Start i hovedsoftwarevinduet, og klik på Hent eksempeldata efterfulgt af OK-knappen i starteksempellisten, der køres for at indsamle data. For at behandle dataene skal du vælge måldatarækken og klikke på kromatogramvinduet for at se MS-scanningskromatogrammet.I kromatogramvinduet skal du klikke på Skærm efterfulgt af TIC. Når du har klikket på scanningsbølgen DS, skal du tilføje spor og OK for at få dattermassespektrescanningen. Kromatogrammet af 2, 4-dibromphenol-behandlet gulerod callus ekstrakt viste tilstedeværelsen af otte forskellige metabolitter sammenlignet med kontrolprøverne.Derudover indikerer fraværet af forælder 2, 4-dibromphenoltop fra kromatogrammet den hurtige metabolisme af 2, 4-dibromphenol i gulerodscallus under eksperimentelle betingelser. Desuden førte 2, 4-dibromphenol inkuberet i gulerodscallus til dannelsen af metabolitter ved direkte konjugering med glucose og aminosyrer. Alt udstyr samt Murashige og Skoog-mediet skal autoklaveres for at sikre, at differentieringen og vedligeholdelsen af plantens callus udføres under aseptiske forhold.Omics-tilgange, der følger denne procedure, gør det muligt at skabe et klart fytotoksisk mekanistisk billede af miljøforurenende stoffer.

Research

JoVE Journal

Environment

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Ekspression af rekombinant Cellulase Cel5A fra<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; I tobaksplanter

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Måling Flusmidler af mineralske Næringsstoffer og giftstoffer i Planter med radioaktive sporstoffer

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Anvendelsen af ​​høj opløsning Infrarød termografi (HRIT) for Studiet af isnukleering og Ice Formering i Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Måling Satser for Ukrudtsmiddel Metabolisme i tokimbladede Ukrudt med en udskåret Leaf Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

LC-MS analyse af humane blodplader som en platform for at studere Mitokondriel Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Enhancement of the Initial Growth Rate of Agricultural Plants by Using Static Magnetic Fields

Forbedring af Initial Growth Rate Jordbrugsvidenskabelige Planter efter hjælp statiske magnetfelter

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing ...

Assessment of Methane and Nitrous Oxide Fluxes from Paddy Field by Means of Static Closed Chambers Maintaining Plants Within Headspace

Vurdering af metan og lattergas strømme fra rismark ved statisk lukkede kamre opretholde planter inden for Headspace

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plante infektion Test: Spray og sår-medieret podning med plante patogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

Protokol for at producere tredimensionale infrarød Video af frysning i planter

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

En løkke-medieret isotermisk forstærkning (lampe) Assay til hurtig identifikation af Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...