Name: elucidating the metabolism of 2,4-dibromophenol in plants
Uploaded: 2023-02-10T12:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (21976160) en het Zhejiang Province Public Welfare Technology Application Research Project (LGF21B070006).

1. Differentiatie van wortel callus
OPMERKING: Autoclaaf alle apparatuur die hier wordt gebruikt en voer alle bewerkingen uit in een UV-gesteriliseerde ultraschone werkbank.
<ol><li>Vernaliseer de zaden door de uniforme wortelzaden (Daucus carota var. sativus) gedurende 16 uur onder te dompelen in gedeïoniseerd water bij 4 °C.</li>
	<li>Steriliseer de vernalized zaden gedurende 20 minuten met 75% ethanol en spoel vervolgens drie keer met steriel gedeïoniseerd wat...

<ol>
	<li>Chakraborty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baseline+investigation+on+plasticizers,+bisphenol+A,+polycyclic+aromatic+hydrocarbons+and+heavy+metals+in+the+surface+soil+of+the+informal+electronic+waste+recycling+workshops+and+nearby+open+dumpsites+in+Indian+metropolitan+cities.">Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities.</a> Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).</li><li>Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence,+fate+and+environmental+risk+of+anionic+surfactants,+bisphenol+A,+perfluorinated+compounds+and+personal+care+products+in+sludge+stabilization+treatments.">Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments.</a> Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).</li><li>Xu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+and+occurrence+of+bisphenol+A+and+thirteen+structural+analogs+in+soil.">Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil.</a> Chemosphere. 277, 130232 (2021).</li><li>Cai, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+nonylphenol+and+nonylphenol+monoethoxylate+in+soil+and+vegetables+from+vegetable+farms+in+the+Pearl+River+Delta,+South+China.">Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China.</a> Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).</li><li>Wang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Migration+and+health+risks+of+nonylphenol+and+bisphenol+a+in+soil-winter+wheat+systems+with+long-term+reclaimed+water+irrigation.">et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).</li><li>Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isomer-specific+approach+to+endocrine-disrupting+nonylphenol+in+infant+food.">An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).</li><li>Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pesticide+metabolism+in+plants+and+microorganisms.">Pesticide metabolism in plants and microorganisms.</a> Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).</li><li>Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+callus+cultures+to+elucidate+the+metabolism+of+tebuconazole,+flurtamone,+fenhexamid,+and+metalaxyl-M+in+Brassica+napus+L.,+Glycine+max+(L.)+Merr.,+Zea+mays+L.,+and+Triticum+aestivum+L.">Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).</li><li>Macherius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolization+of+the+bacteriostatic+agent+triclosan+in+edible+plants+and+its+consequences+for+plant+uptake+assessment.">Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment.</a> Environmental Science &amp; Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).</li><li>Sun, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+metabolism+of+nonylphenol+in+plants:+Isomer+selectivity+involved+with+direct+conjugation.">Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation.</a> Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).</li><li>Schymanski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry:+communicating+confidence.">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental Science &amp; Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).</li><li>Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Household+dust+as+a+repository+of+chemical+accumulation:+new+insights+from+a+comprehensive+high-resolution+mass+spectrometric+study.">Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study.</a> Environmental Science &amp; Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxylated+PBDEs+and+brominated+phenolic+compounds+in+particulate+matters+emitted+during+recycling+of+waste+printed+circuit+boards+in+a+typical+e-waste+workshop+of+South+China.">Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China.</a> Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).</li><li>de Wit, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+brominated+flame+retardants+in+the+environment.">An overview of brominated flame retardants in the environment.</a> Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).</li><li>Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Uptake+and+Metabolism+of+e,4-Dibromophenol+in+Carrot:+In+Vitro+Enzymatic+Direct+Conjugation.">Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).</li><li>Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+framework+for+identifying+toxic+transformation+products+in+complex+environmental+mixtures.">Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).</li><li>Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontarget+screening+with+high+resolution+mass+spectrometry+in+the+environment:+ready+to+go.">Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go.</a> Environmental Science &amp; Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).</li><li>Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplays+between+the+cell+wall+and+phytohormones+in+interaction+between+plants+and+necrotrophic+pathogens.">Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens.</a> Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+metabolic+pathways+of+2,4,6-tribromophenol+in+rice+plants.">Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).</li><li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+of+tetrabromobisphenol+A+in+pumpkin.">Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).</li></ol>

Dit protocol is ontwikkeld om de biotransformatie van xenobiotica in planten efficiënt te identificeren. De cruciale stap van dit protocol is de cultuur van het planteel. Het moeilijkste deel is de differentiatie en het onderhoud van het planteneel, omdat het planteneelt gemakkelijk wordt geïnfecteerd en ontwikkeld tot plantenweefsels. Daarom is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle gebruikte apparatuur wordt geautoclaveerd en dat alle bewerkingen onder aseptische omstandigheden worden uitgevoerd. De differentiat...

Een toenemend aantal organische verontreinigende stoffen is in het milieu gegooid als gevolg van antropogene activiteiten1,2, en de bodem wordt beschouwd als een belangrijke put voor deze verontreinigingen 3,4. De verontreinigingen in de bodem kunnen door planten worden opgenomen en mogelijk worden overgedragen op organismen op een hoger trofisch niveau langs voedselketens, door rechtstreeks het menselijk lichaam binnen te dringen via gewasconsumptie, wat leidt tot onbedoelde blootstelling 5,6. Planten gebruiken verschillende routes om xenobiotica te metaboliseren voor ontgifting7; Het ophelderen van het metabolisme van xenobiotica is belangrijk, omdat het het feitelijke lot van verontreinigingen in planten beheerst. Aangezien de metabolieten door bladeren (naar de atmosfeer) of de wortels kunnen worden uitgescheiden, biedt het bepalen van de metabolieten in de zeer vroege stadia van blootstelling dus de mogelijkheid om een uitgebreid aantal metabolieten te testen8. Studies met intacte planten vereisen echter langetermijnexperimenten en complexe monstervoorbereidingsprotocollen die door verschillende factoren kunnen worden beïnvloed.
Plantaardige eeltculturen zijn daarom een goed alternatief voor het bestuderen van het metabolisme van xenobiotica in planta, omdat ze de behandelingstijd aanzienlijk kunnen verkorten. Deze culturen sluiten microbiële interferentie en fotochemische afbraak uit, vereenvoudigen het matrixeffect van intacte planten, standaardiseren de teeltomstandigheden en vereisen minder experimentele inspanning. Plantaardige eeltculturen zijn met succes toegepast als een alternatieve benadering in metabole studies van triclosan9, nonylfenol10 en tebuconazol8. Deze studies toonden aan dat de metabole patronen in eeltculturen vergelijkbaar waren met die in intacte planten. Deze studie stelt een methode voor voor de efficiënte en nauwkeurige identificatie van metabolieten van xenobiotica in planten zonder complexe en tijdrovende protocollen. Hier gebruiken we plantaardige eeltculturen in combinatie met hoge resolutie massaspectrometrie voor de analyse van metabolieten met lage intensiteit signalen11,12.
Hiertoe werden wortel (Daucus carota var. sativus) eeltsuspensies gedurende 120 uur blootgesteld aan 100 μg/l 2,4-dibroomfenol in een schudder bij 130 tpm en 26 °C. 2,4-dibroomfenol werd gekozen vanwege de verstorende endocriene activiteit13 en het wijdverbreide voorkomen in bodem14. De metabolieten werden geëxtraheerd en geanalyseerd met behulp van hoge resolutie massaspectrometrie. Het hier voorgestelde protocol kan het in planta-metabolisme onderzoeken van andere soorten organische verbindingen die kunnen worden geïoniseerd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4-dichlorophenoxyacetic acid</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>1 mg/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% H2O2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>10011218-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-n-NP, &#62;99%</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-n-NP-d4</td>
			<td>Pointe-Claire</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-benzylaminopurine</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>0.5 mg/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>1269101-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7890A-5975&#160;gas chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQULTY ultra-performance&#160;liquid chromatography</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber glass vials</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial climate incubator</td>
			<td>Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD</td>
			<td>RDN-1000A-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaves</td>
			<td>STIK</td>
			<td>MJ-Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column</td>
			<td>ACQUITY UPLC BEH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-5MS capillary column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40071190-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>SCIENTZ&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-throughput tissue grinder</td>
			<td>SCIENTZ&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrOTOF-QII mass spectrometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MS1922801-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium</td>
			<td>HOPEBIO</td>
			<td>HB8469-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H109658-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen blowing instrument&#160;</td>
			<td>AOSHENG</td>
			<td>MD200-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP isomers, &#62;99%</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB cartridges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>60 mg/3 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>100-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)&#160;</td>
			<td>Shouguang Seed Industry Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking&#160;Incubators</td>
			<td>Shanghai bluepard instruments Co.,ltd.</td>
			<td>THZ-98AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid phase extractor</td>
			<td>AUTO SCIENCE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound machine</td>
			<td>ZKI</td>
			<td>UC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-sterilized ultra-clean workbench</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

elucidating the metabolism of 2,4-dibromophenol in plants

Gewassen kunnen op grote schaal worden blootgesteld aan organische verontreinigende stoffen, omdat de bodem een belangrijke put is voor verontreinigende stoffen die in het milieu worden weggegooid. Dit creëert potentiële blootstelling van de mens door de consumptie van verontreinigende voedingsmiddelen. Het ophelderen van de opname en het metabolisme van xenobiotica in gewassen is essentieel voor de beoordeling van het blootstellingsrisico via de voeding bij de mens. Voor dergelijke experimenten vereist het gebruik van intacte planten echter langetermijnexperimenten en complexe monstervoorbereidingsprotocollen die door verschillende factoren kunnen worden beïnvloed. Planteneeltculturen in combinatie met hoge-resolutie massaspectrometrie (HRMS) kunnen een oplossing bieden voor de nauwkeurige en tijdbesparende identificatie van metabolieten van xenobiotica in planten, omdat het interferentie van de microbiële of schimmelmicro-omgeving kan voorkomen, de behandelingsduur kan verkorten en het matrixeffect van intacte planten kan vereenvoudigen. 2,4-dibroomfenol, een typische vlamvertrager en hormoonontregelaar, werd als modelstof gekozen vanwege het wijdverbreide voorkomen ervan in de bodem en het opnamepotentieel ervan door planten. Hierin werd planteelt gegenereerd uit asepsiszaden en blootgesteld aan steriel 2,4-dibroomfenolbevattend cultuurmedium. De resultaten toonden aan dat acht metabolieten van 2,4-dibroomfenol werden geïdentificeerd in de eeltweefsels van de plant na 120 uur incubatie. Dit geeft aan dat 2,4-dibroomfenol snel werd gemetaboliseerd in de eeltweefsels van de plant. Het platform voor planteneelkweek is dus een effectieve methode om de opname en het metabolisme van xenobiotica in planten te evalueren.

De stappen van het protocol zijn weergegeven in figuur 1. Volgens het protocol vergeleken we het chromatogram van het worteleeltextract van de 2,4-dibroomfenolbehandeling met de controles en vonden acht verschillende pieken die aanwezig zijn in de 2,4-dibroomfenolbehandeling, maar afwezig in de controles (figuur 2). Dit geeft aan dat in totaal acht metabolieten van 2,4-dibroomfenol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 en M187) met succes werden gedetecteerd...

Watch this Scientific Journal Video about Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants at JoVE.com

Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte methode voor de identificatie van 2,4-dibroomfenolmetabolieten in planten.

Opheldering van het metabolisme van 2,4-dibroomfenol in planten

Crops can be extensively exposed to organic pollutants, since soil is a major sink for pollutants discarded into the environment. This creates potential ...

Planteneeltcultuur biedt een oplossing voor de nauwkeurige, efficiënte en snelle evaluatie van metabole afbraak van xenobiotica in planten. Planteneeltcultuur kan microbioom- of schimmelinterferentie en fotochemische afbraak uitsluiten, het matrixeffect van intacte planten vereenvoudigen, de teeltomstandigheden standaardiseren, de behandelingsduur verkorten en minder experimentele inspanning vereisen. De hier voorgestelde methode kan inzicht geven in het opnamegedrag en de metabolische mechanismen van verschillende organische verontreinigende stoffen op gewassen en is nuttig voor inspanningen op het gebied van milieurisicobeoordelingen.Om te beginnen, autoclaaf alle apparatuur en voer alle bewerkingen uit in een UV-gesteriliseerde ultra schone werkbank. Steriliseer het vernaliseerde zaadoppervlak met 75% ethanol gedurende 20 minuten. Spoel ze drie keer af met steriel gedeïoniseerd water en steriliseer ze opnieuw met 20% waterstofperoxide gedurende 20 minuten.Na het wassen van de zaden met gesteriliseerd gedeïoniseerd water zes keer, ontkiem ze aseptisch door te zaaien op autoclaver, hormoonvrij Murashige en Skoog medium van pH 5,8 met 1% agargel en incubeer bij 26 graden Celsius met 16 uur fotoperiode gedurende 15 dagen. Snijd na 15 dagen zaadincubatie de hypocotyl en zaadlob van de zaailing in kleine stukjes van 0,5 centimeter om de explantaten te verkrijgen. Transformeer de explantaten in een petrischaaltje met 15 tot 20 milliliter geautoclaveerde Murashige en Skoog medium aangevuld met Oxymon en Phycocyanine en incubeer in het donker bij 26 graden Celsius gedurende drie tot vier weken om het eelt op te wekken.Scheid met behulp van een steriel scalpel en een tang de eelt van ongeveer een centimeter diameter gevormd van de eerste explantaten. Los voor de behandeling 2, 4-dibroomfenol op in 10 milliliter aseptische vloeistof Murashige en Skoog medium. Voeg vervolgens drie gram gescheiden worteleelt toe aan de bereide 2, 4-dibroomfenoloplossing.Nadat u het medium in blanco controle hebt voorbereid zoals beschreven in het manuscript, incubeer u alle kolven in het donker. Om het monster te bereiden, scheidt u het eelt zorgvuldig van de 2, 3-dibroomfenolbehandeling en controlekolven door filtratie met glasvezelfilters van 0,45 micron. Was het eelt drie keer met ultrapuur water voordat je het verzamelt.Vriesdroog al het verzamelde eelt en homogeniseer 0,2 gram gedroogd eelt met een high throughput weefselmolen op 70 hertz gedurende drie minuten. Gebruik een glazen microspuit om gedurende één minuut 50 microliter surrogaat gedeutereerd 4-n-nanofenol toe te voegen aan de gehomogeniseerde callus en vortex. Voeg vijf milliliter van de oplossing met een gelijke verhouding van methanol en water toe aan de puntige callus en soniceer deze gedurende 30 minuten om de 2, 4-dibroomfenol en metabolieten te extraheren.Na extractie, centrifugeer de suspensie bij 8.000 G bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten en verzamel het supernatant door pipetteren. Laat het extract door hydrofiele lipofiele gebalanceerde vastefase-extractie of HLB-SPE-patroon met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut lopen. Verdun de analyten door zes milliliter methanol door de HLB-SPE-patroon te leiden.Concentreer vervolgens het verkregen eluent tot één milliliter onder een zachte stroom stikstofgas voor instrumentele analyse. Open voor analyse de deur van de kolomverwarming. Installeer vervolgens de ultraperformante vloeistofchromatografiekolom door de kolominlaat aan te sluiten op de injectieklep en de uitlaat op de inlaat van de massaspectrometer.Steek het uiteinde van de oplosmiddelbuizen A en B in de overeenkomstige oplosmiddelflessen. Plaats de injectieflacons met serienummer op de overeenkomstige plaatsen van de monsterbakken en plaats de monsterbakken opnieuw in de monsterkamer. Klik in het softwarevenster op Instrument en vervolgens op Inlaatmethode om de voorwaarden voor het vloeistofchromatogram te bewerken.Selecteer MS-methode en stel de parameters van massaspectrumanalyse in. Klik op Bestand en vervolgens op Nieuw om de database te maken en een naam te geven. Laad het hierboven gemaakte voorbeeldprogramma door MS File te selecteren, gevolgd door Inlet File en Inject Volume.Sla de database op in de voorbeeldmap van het project door op Bestand en opslaan te klikken. Selecteer vervolgens Uitvoeren en starten in het hoofdvenster van de software en klik op Voorbeeldgegevens verkrijgen, gevolgd door de knop OK in de startvoorbeeldlijst om gegevens te verzamelen. Om de gegevens te verwerken, selecteert u de rij met doelgegevens en klikt u op het chromatogramvenster om het MS-scanchromatogram te bekijken.Klik in het chromatogramvenster op Display, gevolgd door TIC. Nadat u op de scangolf DS hebt geklikt, voegt u trace en OK toe om de dochtermassaspectracan te krijgen. Het chromatogram van 2, 4-dibroomfenol-behandeld worteleeltextract toonde de aanwezigheid van acht verschillende metabolieten in vergelijking met de controlemonsters.Bovendien duidt de afwezigheid van ouder 2, 4-dibroomfenolpiek uit het chromatogram op het snelle metabolisme van 2, 4-dibroomfenol in de worteleelt onder experimentele omstandigheden. Bovendien leidde 2, 4-dibroomfenol geïncubeerd in wortel callus tot de vorming van metabolieten door directe conjugatie met glucose en aminozuren. Alle apparatuur en het Murashige- en Skoog-medium moeten worden geautoclaveerd om ervoor te zorgen dat de differentiatie en het onderhoud van de planteelt onder aseptische omstandigheden worden uitgevoerd.Omics-benaderingen die deze procedure volgen, maken het mogelijk om een duidelijk fytotoxisch mechanistisch beeld van milieuverontreinigende stoffen te creëren.

Research

JoVE Journal

Environment

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Expressie van recombinant Cellulase Cel5A uit<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In tabaksplanten

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Het meten van stromen van minerale nutriënten en toxische stoffen in planten met radioactieve tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Het gebruik van een hoge resolutie infrarood thermografie (HRIT) voor de studie van Ice Nucleatie en Ice Voortplanting in Planten

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Meten tarieven herbicide Metabolisme in Dicot Onkruid met een weggesneden Leaf Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

LC-MS analyse van menselijke bloedplaatjes als een platform voor het bestuderen van mitochondriaal Metabolisme

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Enhancement of the Initial Growth Rate of Agricultural Plants by Using Static Magnetic Fields

Verbetering van de initiële groei van landbouwgewassen met behulp van statische magnetische velden

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing ...

Assessment of Methane and Nitrous Oxide Fluxes from Paddy Field by Means of Static Closed Chambers Maintaining Plants Within Headspace

Beoordeling van methaan en distikstofoxide (lachgas) stromen uit Paddy veld door middel van de Static gesloten kamers behoud van planten binnen Headspace

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based ...

Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

Protocol voor het produceren van driedimensionale infrarood Video van bevriezing in planten

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

Een lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) Assay voor snelle identificatie van Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Xylem water distributie in houtachtige planten gevisualiseerd met een Cryo-Scanning elektronenmicroscoop

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...