Name: elucidating the metabolism of 2,4-dibromophenol in plants
Uploaded: 2023-02-10T12:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (21976160) ופרויקט מחקר יישומי טכנולוגיית רווחה ציבורית במחוז ג'ג'יאנג (LGF21B070006).

1. הבחנה של יבלת גזר
הערה: Autoclave כל הציוד המשמש כאן ולבצע את כל הפעולות בשולחן עבודה מעוקר UV אולטרה נקי.
<ol><li>ורנליזציה של הזרעים על ידי טבילת זרעי גזר אחידים (Daucus carota var. sativus) לתוך מים deionized ב 4 ° C במשך 16 שעות.</li>
	<li>יש לעקר את הזרעים הוורנליים עם 75% אתנול למשך 20 דקות,...

<ol>
	<li>Chakraborty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baseline+investigation+on+plasticizers,+bisphenol+A,+polycyclic+aromatic+hydrocarbons+and+heavy+metals+in+the+surface+soil+of+the+informal+electronic+waste+recycling+workshops+and+nearby+open+dumpsites+in+Indian+metropolitan+cities.">Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities.</a> Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).</li><li>Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence,+fate+and+environmental+risk+of+anionic+surfactants,+bisphenol+A,+perfluorinated+compounds+and+personal+care+products+in+sludge+stabilization+treatments.">Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments.</a> Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).</li><li>Xu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+and+occurrence+of+bisphenol+A+and+thirteen+structural+analogs+in+soil.">Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil.</a> Chemosphere. 277, 130232 (2021).</li><li>Cai, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+nonylphenol+and+nonylphenol+monoethoxylate+in+soil+and+vegetables+from+vegetable+farms+in+the+Pearl+River+Delta,+South+China.">Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China.</a> Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).</li><li>Wang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Migration+and+health+risks+of+nonylphenol+and+bisphenol+a+in+soil-winter+wheat+systems+with+long-term+reclaimed+water+irrigation.">et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).</li><li>Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isomer-specific+approach+to+endocrine-disrupting+nonylphenol+in+infant+food.">An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).</li><li>Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pesticide+metabolism+in+plants+and+microorganisms.">Pesticide metabolism in plants and microorganisms.</a> Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).</li><li>Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+callus+cultures+to+elucidate+the+metabolism+of+tebuconazole,+flurtamone,+fenhexamid,+and+metalaxyl-M+in+Brassica+napus+L.,+Glycine+max+(L.)+Merr.,+Zea+mays+L.,+and+Triticum+aestivum+L.">Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).</li><li>Macherius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolization+of+the+bacteriostatic+agent+triclosan+in+edible+plants+and+its+consequences+for+plant+uptake+assessment.">Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment.</a> Environmental Science &amp; Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).</li><li>Sun, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+metabolism+of+nonylphenol+in+plants:+Isomer+selectivity+involved+with+direct+conjugation.">Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation.</a> Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).</li><li>Schymanski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry:+communicating+confidence.">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental Science &amp; Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).</li><li>Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Household+dust+as+a+repository+of+chemical+accumulation:+new+insights+from+a+comprehensive+high-resolution+mass+spectrometric+study.">Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study.</a> Environmental Science &amp; Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxylated+PBDEs+and+brominated+phenolic+compounds+in+particulate+matters+emitted+during+recycling+of+waste+printed+circuit+boards+in+a+typical+e-waste+workshop+of+South+China.">Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China.</a> Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).</li><li>de Wit, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+brominated+flame+retardants+in+the+environment.">An overview of brominated flame retardants in the environment.</a> Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).</li><li>Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Uptake+and+Metabolism+of+e,4-Dibromophenol+in+Carrot:+In+Vitro+Enzymatic+Direct+Conjugation.">Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).</li><li>Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+framework+for+identifying+toxic+transformation+products+in+complex+environmental+mixtures.">Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).</li><li>Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontarget+screening+with+high+resolution+mass+spectrometry+in+the+environment:+ready+to+go.">Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go.</a> Environmental Science &amp; Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).</li><li>Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplays+between+the+cell+wall+and+phytohormones+in+interaction+between+plants+and+necrotrophic+pathogens.">Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens.</a> Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+metabolic+pathways+of+2,4,6-tribromophenol+in+rice+plants.">Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).</li><li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+of+tetrabromobisphenol+A+in+pumpkin.">Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).</li></ol>

פרוטוקול זה פותח כדי לזהות ביעילות את הביוטרנספורמציה של קסנוביוטיקה בצמחים. השלב הקריטי של פרוטוקול זה הוא התרבות של יבלת הצמח. החלק הקשה ביותר הוא התמיינות ותחזוקה של יבלת הצמח, מכיוון שהיבלת הצמחית נגועה בקלות ומתפתחת לרקמות הצמח. לכן, חשוב לוודא כי כל הציוד המשמש הוא autoclaved, וכל הפעולות...

מספר גדל והולך של מזהמים אורגניים הושלכו לסביבה עקב פעילות אנתרופוגנית1,2, והקרקע נחשבת לכיור עיקרי עבור מזהמים אלה 3,4. המזהמים בקרקע יכולים להיקלט על ידי צמחים ולהיות מועברים פוטנציאלית לאורגניזמים ברמה טרופית גבוהה יותר לאורך שרשראות מזון, על ידי כניסה ישירה לגוף האדם באמצעות צריכת יבולים, וכתוצאה מכך להוביל לחשיפה לא מכוונת 5,6. צמחים משתמשים במסלולים שונים כדי לעכל קסנוביוטיקה לניקוי רעלים7; הבהרת חילוף החומרים של קסנוביוטיקה חשובה, שכן היא שולטת בגורלם האמיתי של מזהמים בצמחים. מכיוון שהמטבוליטים יכולים להיות מופרשים על ידי עלים (לאטמוספירה) או שורשים, קביעת המטבוליטים בשלבים המוקדמים מאוד של החשיפה ולכן מספקת את האפשרות לבדוק מספר רב של מטבוליטים8. עם זאת, מחקרים המשתמשים בצמחים שלמים דורשים ניסויים ארוכי טווח ופרוטוקולי הכנת דגימות מורכבים שיכולים להיות מושפעים מגורמים שונים.
תרביות יבלות צמחיות, אם כן, הן חלופה טובה לחקר חילוף החומרים של קסנוביוטיקה בצמח, שכן הן יכולות לקצר מאוד את זמן הטיפול. תרביות אלה שוללות הפרעות מיקרוביאליות ופירוק פוטוכימי, מפשטות את אפקט המטריצה של צמחים שלמים, מתקננות את תנאי הגידול ודורשות פחות מאמץ ניסיוני. תרביות יבלות צמחיות יושמו בהצלחה כגישה חלופית במחקרים מטבוליים של טריקלוזן9, נונילפנול10 וטבוקונזול8. מחקרים אלה הראו כי הדפוסים המטבוליים בתרביות יבלות היו דומים לאלה שבצמחים שלמים. מחקר זה מציע שיטה לזיהוי יעיל ומדויק של מטבוליטים של קסנוביוטיקה בצמחים ללא פרוטוקולים מורכבים וגוזלי זמן. כאן, אנו משתמשים בתרביות יבלות צמחיות בשילוב עם ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה לניתוח מטבוליטים עם אותות בעוצמה נמוכה11,12.
לשם כך, תרחיפים של יבלת גזר (Daucus carota var. sativus) נחשפו ל-100 מיקרוגרם/ליטר של 2,4-דיברומופנול במשך 120 שעות בשייקר ב-130 סל"ד וב-26 מעלות צלזיוס. 2,4-דיברומופנול נבחר בשל פעילותו האנדוקרינית המשבשת13 והופעתו הנרחבת בקרקע14. המטבוליטים חולצו ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה. הפרוטוקול המוצע כאן יכול לחקור את חילוף החומרים בצמח של סוגים אחרים של תרכובות אורגניות שניתן ליונן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4-dichlorophenoxyacetic acid</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>1 mg/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% H2O2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>10011218-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-n-NP, &#62;99%</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-n-NP-d4</td>
			<td>Pointe-Claire</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-benzylaminopurine</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>0.5 mg/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>1269101-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7890A-5975&#160;gas chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQULTY ultra-performance&#160;liquid chromatography</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber glass vials</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial climate incubator</td>
			<td>Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD</td>
			<td>RDN-1000A-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaves</td>
			<td>STIK</td>
			<td>MJ-Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column</td>
			<td>ACQUITY UPLC BEH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-5MS capillary column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40071190-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>SCIENTZ&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-throughput tissue grinder</td>
			<td>SCIENTZ&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrOTOF-QII mass spectrometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MS1922801-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium</td>
			<td>HOPEBIO</td>
			<td>HB8469-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H109658-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen blowing instrument&#160;</td>
			<td>AOSHENG</td>
			<td>MD200-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP isomers, &#62;99%</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB cartridges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>60 mg/3 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>100-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)&#160;</td>
			<td>Shouguang Seed Industry Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking&#160;Incubators</td>
			<td>Shanghai bluepard instruments Co.,ltd.</td>
			<td>THZ-98AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid phase extractor</td>
			<td>AUTO SCIENCE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound machine</td>
			<td>ZKI</td>
			<td>UC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-sterilized ultra-clean workbench</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

elucidating the metabolism of 2,4-dibromophenol in plants

גידולים חקלאיים עלולים להיחשף באופן נרחב למזהמים אורגניים, שכן הקרקע מהווה שקע מרכזי למזהמים המושלכים לסביבה. כך נוצרת חשיפה פוטנציאלית של בני אדם באמצעות צריכת מזונות שהצטברו במזהמים. הבהרת הספיגה והמטבוליזם של קסנוביוטיקה בגידולים חיונית להערכת הסיכון לחשיפה תזונתית בבני אדם. עם זאת, עבור ניסויים כאלה, השימוש בצמחים שלמים דורש ניסויים ארוכי טווח ופרוטוקולים מורכבים להכנת דגימות שיכולים להיות מושפעים מגורמים שונים. תרביות יבלות צמחיות בשילוב עם ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה (HRMS) עשויות לספק פתרון לזיהוי מדויק וחוסך זמן של מטבוליטים של קסנוביוטיקה בצמחים, שכן הן יכולות למנוע הפרעה מהמיקרו-סביבה המיקרוביאלית או הפטרייתית, לקצר את משך הטיפול ולפשט את אפקט המטריצה של צמחים שלמים. 2,4-dibromophenol, מעכב בעירה טיפוסי ומשבש אנדוקריני, נבחר כחומר המודל בשל הופעתו הנפוצה בקרקע ופוטנציאל ספיגתו על ידי צמחים. כאן, יבלת צמחית הופקה מזרעי אספסיס ונחשף למדיום תרבית סטרילי המכיל 2,4-דיברומופנול. התוצאות הראו כי שמונה מטבוליטים של 2,4-dibromophenol זוהו ברקמות יבלת הצמח לאחר 120 שעות של דגירה. זה מצביע על כך 2,4-dibromophenol היה מטבוליזם במהירות ברקמות יבלת הצמח. לפיכך, פלטפורמת תרבית יבלת הצמחים היא שיטה יעילה להערכת ספיגה ומטבוליזם של קסנוביוטיקה בצמחים.

שלבי הפרוטוקול מתוארים באיור 1. בעקבות הפרוטוקול, השווינו את הכרומטוגרמה של תמצית יבלת הגזר מהטיפול ב-2,4-דיברומופנול לקבוצת הביקורת, ומצאנו שמונה פסגות ברורות שנמצאות בטיפול ב-2,4-דיברומופנול אך נעדרות בקבוצת הביקורת (איור 2). זה מצביע על כך שבסך הכל שמונה מטב...

Watch this Scientific Journal Video about Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants at JoVE.com

Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ויעילה לזיהוי מטבוליטים של 2,4-דיברומופנול בצמחים.

הבהרת חילוף החומרים של 2,4-דיברומופנול בצמחים

Crops can be extensively exposed to organic pollutants, since soil is a major sink for pollutants discarded into the environment. This creates potential ...

תרבית יבלות צמחיות מספקת פתרון להערכה מדויקת, יעילה ומהירה של פירוק מטבולי של קסנוביוטיקה בצמחים. תרבית יבלות צמחיות יכולה למנוע הפרעות מיקרוביום או פטריות ופירוק פוטוכימי, לפשט את אפקט המטריצה של צמחים שלמים, לתקנן את תנאי הגידול, לקצר את משך הטיפול ולדרוש פחות מאמץ ניסיוני. השיטה המוצעת כאן יכולה לספק תובנה לגבי התנהגות הקליטה והמנגנונים המטבוליים של מזהמים אורגניים שונים בגידולים חקלאיים והם שימושיים למאמצים בהערכת סיכונים סביבתיים.כדי להתחיל, autoclave כל הציוד ולבצע את כל הפעולות בספסל עבודה מעוקר UV אולטרה נקי. יש לעקר את משטח הזרעים הוורנליים עם אתנול 75% למשך 20 דקות. שטפו אותם במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה שלוש פעמים ושוב עקרו אותם עם 20% מי חמצן למשך 20 דקות.לאחר שטיפת הזרעים במים מעוקרים שעברו דה-יוניזציה שש פעמים, יש להנביט אותם על ידי זריעה על מדיום Murashige ו-Skoog נטול הורמונים בעלי pH 5.8 המכיל 1% ג'ל אגר ולדגור ב-26 מעלות צלזיוס עם תקופת צילום של 16 שעות למשך 15 יום. לאחר 15 ימים של דגירה זרעים, לחתוך את hypocotyl ו cotyledon של שתיל לחתיכות קטנות של 0.5 ס"מ כדי לקבל את explants. הפכו את הצמחים בצלחת פטרי המכילה 15 עד 20 מיליליטר של מדיום מורשיג וסקוג עם תוספת של אוקסימון ופיקוציאנין ודגרו בחושך בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד ארבעה שבועות כדי לגרום ליבלת.בעזרת אזמל סטרילי ומלקחיים, מפרידים את היבלת בקוטר של כסנטימטר אחד שנוצרה מהצמחים הראשוניים. לטיפול, להמיס 2, 4-dibromophenol ב 10 מיליליטר של נוזל אספטי Murashige ו Skoog בינוני. לאחר מכן מוסיפים שלושה גרם של יבלת גזר מופרדת לתמיסת 2, 4-dibromophenol המוכנה.לאחר הכנת המדיום בשליטה ריקה כמתואר בכתב היד, דוגרים על כל הצלוחיות בחושך. כדי להכין את הדגימה, להפריד את היבלת בזהירות מן הטיפול 2, 3-dibromophenol טיפול צלוחיות בקרה על ידי סינון עם מסנני סיבי זכוכית 0.45 מיקרון. לשטוף את יבלת שלוש פעמים עם מים טהורים במיוחד לפני איסוף אותו.להקפיא לייבש את כל יבלות שנאספו הומוגניזציה 0.2 גרם של יבלת מיובשת עם מטחנת רקמות תפוקה גבוהה ב 70 הרץ במשך שלוש דקות. השתמש במיקרומזרק זכוכית כדי להוסיף 50 מיקרוליטר של 4-n-nanophenol חלופי לתוך יבלת הומוגנית ומערבולת במשך דקה אחת. הוסף חמישה מיליליטר של התמיסה המכילה יחס שווה של מתנול ומים ליבלת הקוצנית וסוני אותו במשך 30 דקות כדי לחלץ את 2, 4-dibromophenol ומטבוליטים.לאחר החילוץ, צנטריפוגה את המתלה ב 8, 000 G ב ארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאסוף את supernatant על ידי pipetting. העבירו את התמצית דרך מיצוי שלב מוצק הידרופילי ליפופילי מאוזן או מחסנית HLB-SPE בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה. לדלל את האנליטים על ידי העברת שישה מיליליטר מתנול דרך מחסנית HLB-SPE.לאחר מכן רכז את ה- eluent המתקבל למיליליטר אחד תחת זרם עדין של גז חנקן לניתוח אינסטרומנטלי. לניתוח, פתח את דלת מחמם העמודים. לאחר מכן התקן את עמודת הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת הביצועים הגבוהים במיוחד על ידי חיבור כניסת העמודה לשסתום ההזרקה והשקע לכניסת ספקטרומטר המסות.הכנס את קצה צינורות הממס A ו- B לבקבוקי הממס המתאימים. מקם את בקבוקוני הדגימה לפי מספר סידורי במיקומים המתאימים של מגשי הדגימה והכנס מחדש את מגשי הדגימה לתא הדגימה. בחלון התוכנה, לחץ על מכשיר ולאחר מכן על שיטת כניסה כדי לערוך את התנאים עבור הכרומטוגרמה הנוזלית.בחר MS שיטה ולהגדיר את הפרמטרים של ניתוח ספקטרום המסה. לחץ על קובץ ולאחר מכן חדש כדי ליצור את מסד הנתונים ולתת לו שם. טען את התוכנית לדוגמה שנוצרה לעיל על ידי בחירת MS File, ואחריו Inlet File ו- Inject Volume.שמור את מסד הנתונים בתיקיה לדוגמה של הפרוייקט על-ידי לחיצה על קובץ ושמור. לאחר מכן, בחר הפעל והתחל בחלון התוכנה הראשי ולחץ על רכוש נתונים לדוגמה, ואחריו בסדר כפתור ברשימת התחל לדוגמה לרוץ כדי לאסוף נתונים. כדי לעבד את הנתונים, בחר את שורת נתוני היעד ולחץ על חלון הכרומטוגרמה כדי להציג את כרומטוגרמה סריקת MS.בחלון הכרומטוגרמה, לחץ על תצוגה, ואחריו TIC. לאחר לחיצה על גל הסריקה DS, הוסף מעקב ואישור כדי לקבל את סריקת ספקטרום המסה של הבת. הכרומטוגרמה של 2, 4-dibromophenol טיפול גזר callus לחלץ הראה נוכחות של שמונה מטבוליטים שונים לעומת דגימות הביקורת.בנוסף, היעדר שיא הורה 2, 4-dibromophenol מן הכרומטוגרמה מצביע על חילוף חומרים מהיר של 2, 4-dibromophenol בגזר callus בתנאי ניסוי. יתר על כן, 2, 4-dibromophenol מודגר יבלת גזר הוביל להיווצרות של מטבוליטים על ידי צימוד ישיר עם גלוקוז וחומצות אמינו. כל הציוד, כמו גם מדיום Murashige ו Skoog צריך להיות autoclaved כדי לוודא כי בידול ותחזוקה של הצמח callus מבוצעים בתנאים אספטיים.גישות Omics בעקבות הליך זה מאפשרות ליצור תמונה מכניסטית פיטוקסית ברורה של מזהמים סביבתיים.

Research

JoVE Journal

Environment

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ<em&gt; Reesei Trichoderma</em&gt; בצמחים טבק

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

מדידת שטפים של חומרים מזינים ומינרליים רעלים בצמחים עם חומרים רדיואקטיביים

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

השימוש ברזולוציה גבוהה אינפרא אדום תרמוגרפיה (HRIT) לחקר הקרח נוקלאציה וקרח רביה בצמחים

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

מדידת מחירים של קוטל העשבים מטבוליזם בעשבי Dicot עם Assay נכרת עלה

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

ניתוח LC-MS של טסיות האדם כפלטפורמה ללימוד מטבוליזם מיטוכונדריאלי

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Enhancement of the Initial Growth Rate of Agricultural Plants by Using Static Magnetic Fields

שיפור של שיעור הצמיחה הראשוני של צמחים חקלאיים באמצעות שדות מגנטיים סטטיים

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing ...

Assessment of Methane and Nitrous Oxide Fluxes from Paddy Field by Means of Static Closed Chambers Maintaining Plants Within Headspace

הערכה של מתאן והנתיבים תחמוצת החנקן משדה אורז באמצעות חשמל סטטי סגור צ'יימברס שמירה על הצמחים בתוך קראוון

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based ...

Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

פרוטוקול להפקת וידאו תלת ממדי אינפרא-אדום להקפאת בצמחים

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

בתיווך לולאה Assay איזותרמי הגברה (מנורה), עבור זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

התפלגות המים xylem במפעלי וודי דמיינו בעזרת מיקרוסקופ אלקטרוני לסריקת ההקפאה

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...