Name: optimization of the epimedii folium mutton-oil processing technology and testing its effect on zebrafish embryonic development
Uploaded: 2023-03-17T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of the Epimedii Folium Mutton-Oil Processing Technology and Testing Its Effect on Zebrafish Embryonic Development at JoVE.com

Ce travail est soutenu par le projet commercial de recherche scientifique fondamentale de l’Académie de médecine traditionnelle chinoise de Chongqing (numéro de projet: jbky20200013), le projet d’orientation des incitations à la performance des institutions de recherche scientifique de Chongqing (numéro de projet: cstc2021jxjl 130025) et le projet de construction de disciplines clés de la Commission municipale de santé de Chongqing de Chinese Materia Medica Processing.

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées avec l’approbation du Comité d’éthique des expériences de l’Institut de MTC de Chongqing (numéro de certificat d’examen éthique des animaux de laboratoire : ZJS2022-03).
1. Détermination des composants bioactifs
NOTE: L’espèce utilisée dans cette recherche était Epimedium sagittatum, et les échantillons ont été collectés dans le comté de Fengdu, Chongqing. L’?...

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	<li>Chinese Pharmacopoeia Commission. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chinese Pharmacopoeia. Volume I. , (2020).</li><li>Wang, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Collection of Traditional Chinese Medicine Processing Methods. , (1998).</li><li>Chen, L. L., Jia, X. B., Jia, D. 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Variables indépendantes et détermination de leurs niveaux La technologie de traitement EF n’est décrite que dans l’édition 2020 de la pharmacopée chinoise et les spécifications de traitement de la médecine chinoise locale publiées par 26 provinces, municipalités et régions autonomes à travers le pays1. La description comprend les étapes suivantes: prendre de l’huile de mouton et la chauffer pour la faire fondre, ajouter des lambeaux EF, faire sauter à feu len...

Epimedii folium (EF) est les feuilles séchées d’Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., ou Epimedium koreanum Nakai. EF peut être utilisé pour traiter l’ostéoporose, le syndrome ménopausique, les masses mammaires, l’hypertension, les maladies coronariennes et d’autres maladies1. En tant que médecine traditionnelle chinoise (MTC), EF a une histoire de plus de 2 000 ans dans la médecine et l’alimentation. En raison de son faible prix et de son effet remarquable de tonifier les reins, il est largement utilisé dans les médicaments et les aliments santé. L’EF est traité en le faisant sauter avec de l’huile de mouton, un processus décrit pour la première fois dans la théorie du traitement du Lei Gong écrite par Lei Xiao dans la période2 de Liu Song. Les efficacités de l’EF brut et de l’EF sauté sont très différentes. L’EF brut dissipe principalement les rhumatismes, tandis que le FE sauté réchauffe les reins pour renforcer le yang3. À l’heure actuelle, l’EF est largement utilisé comme matière première dans les médicaments et les aliments santé; il y a 399 médicaments brevetés chinois répertoriés, neuf aliments santé importés et 455 aliments santé nationaux avec EF comme matière première4. Ce médicament a de grandes perspectives d’application. Cependant, au cours des dernières années, de plus en plus de réactions indésirables et de lésions hépatiques humaines causées par des aliments santé et des médicaments brevetés chinois utilisant l’EF comme matière première, et des études de toxicité connexes 5,6,7 ont indiqué que l’EF en tant que matière première présente des risques potentiels pour la sécurité.
Le traitement médicinal chinois fait référence aux techniques pharmaceutiques qui peuvent réduire ou éliminer efficacement la toxicité et améliorer la sécurité des MTC. La méthode de traitement traditionnelle de l’EF est la friture avec de l’huile de mouton, ce qui réduit la toxicité de l’EF et renforce son effet de réchauffement des reins et de promotion du yang8. Cette méthode de traitement est incluse dans la pharmacopée chinoise et diverses spécifications de traitement1. Le procédé d’EF n’est spécifié que comme suit: pour chaque 100 kg d’EF, 20 kg d’huile amniotique (raffinée) sont ajoutés et elle est cuite doucement jusqu’à uniformité et brillante1. Il n’y a pas de paramètres stricts de méthode de traitement EF dans les normes ci-dessus, de sorte que les spécifications de traitement locales n’ont pas été unifiées pour assurer la cohérence. Par conséquent, il serait utile de mener une étude systématique du processus d’EE. Dans cet article, la méthode expérimentale de la surface de conception-réponse de Box-Behnken a été utilisée pour optimiser la technologie de traitement de l’EF.
Le plan expérimental de Box-Behnken est une méthode généralement utilisée pour optimiser les facteurs d’un processus. Les paramètres d’extraction peuvent être optimisés en établissant la relation fonctionnelle entre les facteurs d’ajustement des équations de régression multiples et les valeurs d’effet. Récemment, cette méthode a été largement utilisée pour étudier l’extractionde la MTC 5,6,7 et le traitement9,10,11. Diverses études ont rapporté des méthodes de préparation de la MTC impliquant le traitement du sel, le traitement du vin et le sauté suivant une conception Box-Behnken, telles que pour Psoraleae fructus 12 traité au sel, Cnidii fructus13 traité au vin et Cinnamomi ramulus14 torréfié. Cette méthode a réduit le temps de test, une précision de test élevée et convient aux tests multi-facteurs et multi-niveaux. La méthode est plus simple que la méthode d’essai de conception orthogonale et plus complète que la méthode de conception uniforme15. Les relations obtenues peuvent déterminer la valeur prédite de n’importe quel point de test dans la plage de test, ce qui est un grand avantage. Un modèle de poisson zèbre peut être utilisé pour tester si l’EF est moins toxique après traitement.
Dans les études de toxicité de la MTC, le modèle du poisson zèbre présente le double avantage du débit élevé des expériences cellulaires et des similitudes avec les expériences sur les rongeurs16. Ce modèle se caractérise par sa petite taille, son taux de frai élevé, son cycle de reproduction court et sa facilité de reproduction. Le modèle peut être utilisé dans des expériences synchrones à grande échelle dans des plaques de culture cellulaire, et le dosage du médicament expérimental est faible, le cycle expérimental est court, le coût est faible et l’ensemble du processus expérimental est facile à observer et à utiliser17. Les embryons de poisson zèbre sont transparents et se développent rapidement. Par conséquent, la toxicité et les effets tératogènes des médicaments sur les tissus viscéraux à différents stades de développement peuvent être directement observés au microscope18. L’homologie génétique entre le poisson zèbre et les humains atteint 85 %18. La voie de transduction du signal du poisson zèbre est similaire à celle de l’homme18. La structure biologique et la fonction physiologique du poisson zèbre sont très similaires à celles des mammifères18. Par conséquent, un modèle de poisson zèbre pour les tests de dépistage de drogues peut fournir des animaux de laboratoire fiables et pleinement applicables aux humains19.
Dans cette étude, nous avons utilisé la méthodologie de surface de conception-réponse de Box-Behnken pour optimiser la quantité et la température de l’huile de mouton et la température de friture utilisée dans la technologie de traitement EF, avec les teneurs en icariin, épimédine A, épimédine B, épimédine C et baohuoside I comme indices d’évaluation. Le modèle du poisson-zèbre a été utilisé pour explorer de manière préliminaire l’effet d’un extrait d’eau EF sur le développement embryonnaire du poisson zèbre avant et après le traitement afin d’évaluer l’effet d’atténuation du traitement sur le FE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>197164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baohuoside <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65096/65096eq01.jpg" style="margin: auto;" /> (B<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65096/65096eq01.jpg" style="margin: auto;" /> )&#160;</td>
			<td>Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MUST-20042402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>Symmetry C18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design Expert software</td>
			<td>Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN</td>
			<td>Trial Version8.0.6.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>2998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disintegrator</td>
			<td>Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd.</td>
			<td>S-FS553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic analytical balance</td>
			<td>Mettler-Toledo International Inc.</td>
			<td>MS205DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epimedin A (EA)</td>
			<td>Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MUST-21112118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epimedin B (EB)</td>
			<td>Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MUST-20080403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epimedin C (EC)</td>
			<td>Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MUST-20080310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd.</td>
			<td>20180801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad software</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>6.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Performance Liquid Chromatography (HPLC)</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>2695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Icariin</td>
			<td>Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>21091401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd.</td>
			<td>20171101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microporous membrane</td>
			<td>Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutton oil</td>
			<td>Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store</td>
			<td>20211106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office Excel office software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Office Excel 2021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacopoeia sieve</td>
			<td>Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>R40/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water machine</td>
			<td>Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>AT Sro 10A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper</td>
			<td>Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>18cm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd.</td>
			<td>BUG25-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>China Zebrafish Resource Center (CZRC)</td>
			<td>The AB strain</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of the epimedii folium mutton-oil processing technology and testing its effect on zebrafish embryonic development

En tant que médecine traditionnelle chinoise (MTC), Epimedii folium (EF) a une histoire en médecine et en alimentation vieille de > 2 000 ans. Cliniquement, EF traité avec de l’huile de mouton est souvent utilisé comme médicament. Ces dernières années, les rapports de risques pour la sécurité et de réactions indésirables des produits qui utilisent l’EF comme matière première ont progressivement augmenté. Le traitement peut améliorer efficacement la sécurité de la MTC. Selon la théorie de la MTC, le traitement de l’huile de mouton peut réduire la toxicité de l’EF et renforcer son effet tonifiant sur les reins. Cependant, il y a un manque de recherche et d’évaluation systématiques de la technologie de traitement de l’huile de mouton EF. Dans cette étude, nous avons utilisé la méthodologie expérimentale de la surface de conception-réponse de Box-Behnken pour optimiser les paramètres clés de la technologie de traitement en évaluant le contenu de plusieurs composants. Les résultats ont montré que la technologie optimale de traitement de l’huile de mouton d’EF était la suivante: chauffer l’huile de mouton à 120 ° C ± 10 ° C, ajouter l’EF brut, la faire sauter doucement à 189 ° C ± 10 ° C jusqu’à ce qu’elle soit uniformément brillante, puis la retirer et la refroidir. Pour 100 kg d’EF, 15 kg d’huile de mouton doivent être utilisés. Les toxicités et les tératogénicités d’un extrait aqueux d’EF traité à l’huile brute et à l’huile de mouton ont été comparées dans un modèle de développement embryonnaire de poisson zèbre. Les résultats ont montré que le groupe des herbes brutes était plus susceptible de causer des malformations du poisson zèbre et que sa concentration d’EF létale à moitié maximale était plus faible. En conclusion, la technologie optimisée de traitement de l’huile de mouton était stable et fiable, avec une bonne répétabilité. À une certaine dose, l’extrait aqueux d’EF était toxique pour le développement des embryons de poisson zèbre, et la toxicité était plus forte pour le médicament brut que pour le médicament transformé. Les résultats ont montré que le traitement de l’huile de mouton réduisait la toxicité de l’EF brut. Ces résultats peuvent être utilisés pour améliorer la qualité, l’uniformité et la sécurité clinique de l’EF traité à l’huile de mouton.

Résultats de l’enquête méthodologique Une relation linéaire entre la concentration d’icariin, EA, EB, EC, BI et les zones de pics chromatographiques a été observée (voir le tableau 3). Les valeurs RSD% (n = 6) des zones de pics chromatographiques de l’icariin, EA, EB, EC et BI étaient respectivement de 0,28%, 1,22%, 0,65%, 1,67% et 1,06%, ce qui indique que la précision des mesures HPLC était bonne. Les valeurs RSD% (n = 6) des teneurs en icariin, EA, EB, EC et BI éta...

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Optimization of the Epimedii Folium Mutton-Oil Processing Technology and Testing Its Effect on Zebrafish Embryonic Development

Dans ce protocole, la technologie de traitement de l’huile de mouton d’Epimedii folium (EF) a été optimisée en appliquant une méthodologie expérimentale de surface de conception-réponse de Box-Behnken, et l’effet de l’EF brut et optimisé extrait à l’eau sur le développement embryonnaire du poisson zèbre a été étudié au préalable.

Optimisation de la technologie de traitement de l’huile de mouton Epimedii folium et test de son effet sur le développement embryonnaire du poisson zèbre

As a traditional Chinese medicine (TCM), Epimedii folium (EF) has a history in medicine and food that is &#62; 2,000 years old. Clinically, EF processed ...

Dans cette étude, nous avons adopté une méthode de traitement largement utilisée et acquis une technique persistante stable et fiable. Le résultat a montré que la toxicité des Epimedii transformés était réduite. La méthode de surface de réponse nécessite moins d’expériences et des cycles plus courts, ce qui permet non seulement d’éviter les problèmes existant dans les statistiques mathématiques traditionnelles, mais aussi d’aider les utilisateurs à sélectionner les conditions optimales.Cette méthode peut également être largement utilisée dans l’industrie chimique, le génie biologique, l’industrie alimentaire, la préparation de la médecine chinoise, l’extraction de la médecine chinoise, etc. Après avoir préparé la solution et effectué la chromatographie, sélectionnez les paramètres clés du traitement EF, tels que la quantité d’huile de mouton, la température de l’huile de mouton et la température de friture comme facteurs influents. Utilisez les scores complets du contenu icariin, EA, EB, EC et BI comme indices d’évaluation.Utilisez le logiciel d’analyse de surface de réponse pour concevoir les expériences de surface de réponse de Box-Behnken, explorer la surface de réponse quadratique et construire un modèle polynomial de second ordre. Sélectionnez la nouvelle conception Box-Behnken et définissez l’option Facteurs numériques sur trois. Définissez les facteurs A, B et C.Cliquez sur continuer, puis définissez l’option de réponses sur un, puis cliquez sur continuer pour terminer la conception.Traiter l’EF selon les paramètres spécifiques, par exemple, pour la commande numéro un, où l’huile de mouton raffinée est de 15% volume par volume, puis la chauffer à 50 degrés Celsius pour la faire fondre. Ajouter l’EF brut au mouton fondu. Faire frire sur un feu doux jusqu’à ce qu’il soit uniformément brillant, puis retirer et refroidir l’EF. Préparer les solutions de test des produits transformés et les analyser à l’aide de la CLHP comme décrit dans le manuscrit.Enregistrer les temps de rétention et les zones de pic de chaque composition chimique et calculer les teneurs en icariin, EA, EB, EC et BI dans chaque solution d’essai par rapport à une courbe étalon externe. Calculer les scores complets des 17 groupes expérimentaux à l’aide de la formule de calcul du score complet. Importez les résultats de notation complets pour les 17 groupes d’expériences dans le logiciel d’analyse de données pour analyser les données expérimentales.Sous les éléments d’évaluation, sélectionnez l’option d’ordre de processus quadratique et l’option de type de modèle polynomial. La surface de réponse de la quantité d’huile de mouton et la température de friture étaient plus raides que les autres facteurs testés, et les courbes de niveau avaient tendance à être plus elliptiques, ce qui indique que l’interaction entre ces deux facteurs était plus importante que les interactions entre d’autres facteurs. Le chromatogramme CLHP de la substance de référence mélangée, Epimedii Folium brut et Epimedii Folium produits transformés, démontre que la teneur en BI dans le FE brut est faible, alors qu’elle augmente après transformation.Le groupe brut présente des déformations évidentes de la colonne vertébrale, une courbure corporelle, un œdème péricardique et une déformation du foie à une concentration de médicament de 150 microgrammes par millilitre, alors que ces changements étaient rares chez les poissons juvéniles du groupe transformé. Tous les poissons-zèbres du groupe des médicaments bruts sont morts 24 heures après l’administration de 200 microgrammes par millilitre de médicament, alors que la mortalité dans le groupe traité n’était que de 6,67% L’administration de 200 microgrammes par millilitre d’EF a causé la mort de tous les poissons zèbres du groupe des médicaments bruts après 72 heures, tandis que dans le groupe transformé, 500 microgrammes par millilitre d’EF ont causé la mort de tous les poissons zèbres. La concentration létale médiane des deux groupes expérimentaux 72 heures après la fécondation a montré que la CL 50 était de 151,3 microgrammes par millilitre dans le groupe brut et de 219,8 microgrammes par millilitre dans le groupe traité.La chose la plus importante dans l’expérience est de sélectionner les facteurs de la méthode de surface de réponse et de déterminer les paramètres de ces facteurs.

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