Name: optimization of the epimedii folium mutton-oil processing technology and testing its effect on zebrafish embryonic development
Uploaded: 2023-03-17T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of the Epimedii Folium Mutton-Oil Processing Technology and Testing Its Effect on Zebrafish Embryonic Development at JoVE.com

Questo lavoro è supportato dal Basic Scientific Research Business Project della Chongqing Academy of Traditional Chinese Medicine (numero di progetto: jbky20200013), dal Performance Incentive Guidance Project degli istituti di ricerca scientifica di Chongqing (numero di progetto: cstc2021jxjl 130025) e dal progetto di costruzione della disciplina chiave della Commissione sanitaria municipale di Chongqing di Chinese Materia Medica Processing.

Tutti gli esperimenti relativi agli animali sono stati condotti con l'approvazione del Comitato etico degli esperimenti dell'Istituto di MTC di Chongqing (numero di certificato di revisione etica degli animali da laboratorio: ZJS2022-03).
1. Determinazione dei componenti bioattivi
NOTA: La specie utilizzata in questa ricerca era Epimedium sagittatum, e i campioni sono stati raccolti nella contea di Fengdu, Chongqing. Il campione è stato iden...

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	<li>Chinese Pharmacopoeia Commission. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chinese Pharmacopoeia. Volume I. , (2020).</li><li>Wang, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Collection of Traditional Chinese Medicine Processing Methods. , (1998).</li><li>Chen, L. L., Jia, X. B., Jia, D. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shikonin+on+zebrafish's+embryo+and+angiogenesis.">Effects of shikonin on zebrafish's embryo and angiogenesis.</a> Chinese Traditional Patent Medicine. 38 (2), 241-245 (2016).</li><li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The transformation research on the chemical compositions in the processing of Epimedium. , (2016).</li><li>Xiao, Y. P., Zeng, J., Jiao, L. -. N., Xu, X. -. 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Variabili indipendenti e determinazione dei loro livelli La tecnologia di elaborazione EF è descritta solo nell'edizione 2020 della Farmacopea cinese e nelle specifiche locali di elaborazione della medicina cinese pubblicate da 26 province, comuni e regioni autonome in tutto il paese1. La descrizione prevede i seguenti passaggi: prendere l'olio di montone e riscaldarlo per scioglierlo, aggiungere brandelli EF, saltare in padella a fuoco lento fino a quando non è uniforme e lu...

Epimedii folium (EF) è le foglie essiccate di Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., o Epimedium koreanum Nakai. EF può essere usato per trattare l'osteoporosi, la sindrome della menopausa, noduli al seno, ipertensione, malattia coronarica e altre malattie1. Come medicina tradizionale cinese (MTC), EF ha una storia in medicina e cibo di oltre 2.000 anni. Grazie al suo basso prezzo e al notevole effetto di tonificare i reni, è ampiamente usato in medicinali e alimenti salutari. L'EF viene lavorato saltando in padella con olio di montone, un processo descritto per la prima volta nella teoria dell'elaborazione del Lei Gong scritta da Lei Xiao nel periodo Liu Song2. L'efficacia dell'EF grezzo e dell'EF saltato in padella è molto diversa. L'EF grezzo dissipa principalmente i reumatismi, mentre l'EF saltato in padella riscalda i reni per rinforzare lo yang3. Allo stato attuale, l'EF è ampiamente utilizzato come materia prima nei farmaci e negli alimenti salutari; ci sono 399 farmaci brevettati cinesi elencati, nove alimenti salutari importati e 455 alimenti salutari domestici con EF come materia prima4. Questo medicinale ha grandi prospettive di applicazione. Tuttavia, negli ultimi anni, ci sono state crescenti segnalazioni di reazioni avverse e lesioni epatiche umane causate da alimenti salutari e medicinali brevettati cinesi che utilizzano EF come materia prima, e i relativi studi di tossicità 5,6,7 hanno riferito che l'EF come materia prima ha potenziali rischi per la sicurezza.
L'elaborazione medicinale cinese si riferisce a tecniche farmaceutiche che possono ridurre o eliminare efficacemente la tossicità e migliorare la sicurezza delle MTC. Il metodo di lavorazione tradizionale di EF è la frittura in padella con olio di montone, che riduce la tossicità dell'EF e migliora il suo effetto di riscaldamento dei reni e promozione dello yang8. Questo metodo di lavorazione è incluso nella farmacopea cinese e varie specifiche di lavorazione1. Il processo di EF è specificato solo come segue: per ogni 100 kg di EF, vengono aggiunti 20 kg di olio amniotico (raffinato) e viene cotto in modo delicato fino a quando uniforme e lucido1. Non ci sono parametri rigorosi del metodo di elaborazione EF negli standard di cui sopra, quindi le specifiche di elaborazione locali non sono state unificate per garantire la coerenza. Pertanto, sarebbe utile condurre uno studio sistematico del processo di impronta ambientale. In questo articolo, il metodo sperimentale Box-Behnken della superficie di progettazione-risposta è stato utilizzato per ottimizzare la tecnologia di elaborazione di EF.
Il progetto sperimentale Box-Behnken è un metodo tipicamente utilizzato per ottimizzare i fattori in un processo. I parametri di estrazione possono essere ottimizzati stabilendo la relazione funzionale tra più fattori di adattamento delle equazioni di regressione e valori di effetto. Recentemente, questo metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare l'estrazione TCM 5,6,7 e l'elaborazione 9,10,11. Vari studi hanno riportato metodi di preparazione TCM che coinvolgono la lavorazione del sale, la lavorazione del vino e la frittura in padella seguendo un design Box-Behnken, come per Psoraleae fructus 12 trattato con sale, Cnidii fructus13 lavorato con vino e Cinnamomi ramulus14 arrostito. Questo metodo ha ridotto i tempi di test, un'elevata precisione del test ed è adatto per test multifattoriali e multilivello. Il metodo è più semplice del metodo di prova di progettazione ortogonale e più completo del metodo di progettazione uniforme15. Le relazioni ottenute possono determinare il valore previsto di qualsiasi punto di test all'interno dell'intervallo di test, il che rappresenta un grande vantaggio. Un modello di zebrafish può essere utilizzato per verificare se l'EF è meno tossico dopo la lavorazione.
Negli studi di tossicità TCM, il modello zebrafish presenta il duplice vantaggio dell'elevata produttività degli esperimenti sulle cellule e delle somiglianze con gli esperimenti sui roditori16. Questo modello è caratterizzato da piccole dimensioni, alto tasso di deposizione delle uova, breve ciclo di riproduzione e facilità di allevamento. Il modello può essere utilizzato in esperimenti sincroni su larga scala in piastre di coltura cellulare e il dosaggio del farmaco sperimentale è piccolo, il ciclo sperimentale è breve, il costo è basso e l'intero processo sperimentale è facile da osservare e utilizzare17. Gli embrioni di zebrafish sono trasparenti e si sviluppano rapidamente. Pertanto, la tossicità e gli effetti teratogeni dei farmaci sui tessuti viscerali in diversi stadi di sviluppo possono essere osservati direttamente al microscopio18. L'omologia genica tra zebrafish e umani raggiunge l'85%18. La via di trasduzione del segnale del pesce zebra è simile a quella degli esseri umani18. La struttura biologica e la funzione fisiologica del pesce zebra sono molto simili a quelle dei mammiferi18. Pertanto, un modello di zebrafish per test antidroga può fornire animali da esperimento affidabili e pienamente applicabili agli esseri umani19.
In questo studio, abbiamo utilizzato la metodologia della superficie di progettazione-risposta Box-Behnken per ottimizzare la quantità e la temperatura dell'olio di montone e la temperatura di frittura utilizzata nella tecnologia di lavorazione EF, con i contenuti di icariina, epimedina A, epimedina B, epimedina C e baohuoside I come indici di valutazione. Il modello di zebrafish è stato utilizzato per esplorare preliminarmente l'effetto di un estratto di acqua EF sullo sviluppo embrionale del pesce zebra prima e dopo la lavorazione per valutare l'effetto di attenuazione della lavorazione sull'EF.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>197164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baohuoside <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65096/65096eq01.jpg" style="margin: auto;" /> (B<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65096/65096eq01.jpg" style="margin: auto;" /> )&#160;</td>
			<td>Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MUST-20042402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>Symmetry C18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design Expert software</td>
			<td>Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN</td>
			<td>Trial Version8.0.6.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>2998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disintegrator</td>
			<td>Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd.</td>
			<td>S-FS553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic analytical balance</td>
			<td>Mettler-Toledo International Inc.</td>
			<td>MS205DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epimedin A (EA)</td>
			<td>Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MUST-21112118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epimedin B (EB)</td>
			<td>Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MUST-20080403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epimedin C (EC)</td>
			<td>Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MUST-20080310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd.</td>
			<td>20180801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad software</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>6.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Performance Liquid Chromatography (HPLC)</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>2695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Icariin</td>
			<td>Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>21091401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd.</td>
			<td>20171101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microporous membrane</td>
			<td>Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutton oil</td>
			<td>Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store</td>
			<td>20211106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office Excel office software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Office Excel 2021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacopoeia sieve</td>
			<td>Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>R40/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water machine</td>
			<td>Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>AT Sro 10A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper</td>
			<td>Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>18cm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd.</td>
			<td>BUG25-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>China Zebrafish Resource Center (CZRC)</td>
			<td>The AB strain</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of the epimedii folium mutton-oil processing technology and testing its effect on zebrafish embryonic development

Come medicina tradizionale cinese (MTC), Epimedii folium (EF) ha una storia in medicina e cibo che ha > 2.000 anni. Clinicamente, l'EF elaborato con olio di montone è spesso usato come medicinale. Negli ultimi anni, le segnalazioni di rischi per la sicurezza e reazioni avverse di prodotti che utilizzano EF come materia prima sono gradualmente aumentate. L'elaborazione può migliorare efficacemente la sicurezza della MTC. Secondo la teoria TCM, la lavorazione dell'olio di montone può ridurre la tossicità dell'EF e migliorare il suo effetto tonificante sui reni. Tuttavia, mancano ricerche e valutazioni sistematiche della tecnologia di trattamento dell'olio di montone EF. In questo studio, abbiamo utilizzato la metodologia sperimentale della superficie di progettazione-risposta Box-Behnken per ottimizzare i parametri chiave della tecnologia di lavorazione valutando il contenuto di più componenti. I risultati hanno mostrato che la tecnologia ottimale di lavorazione dell'olio di montone di EF era la seguente: riscaldare l'olio di montone a 120 °C ± 10 °C, aggiungere l'EF grezzo, saltarlo delicatamente a 189 °C ± 10 °C fino a quando non è uniformemente lucido, quindi rimuoverlo e raffreddarlo. Per ogni 100 kg di EF, devono essere utilizzati 15 kg di olio di montone. Le tossicità e le teratogenicità di un estratto acquoso di EF grezzo e olio di montone sono state confrontate in un modello di sviluppo dell'embrione di zebrafish. I risultati hanno mostrato che il gruppo di erbe grezze aveva maggiori probabilità di causare deformità del pesce zebra e la sua concentrazione EF letale semi-massima era inferiore. In conclusione, la tecnologia ottimizzata di lavorazione dell'olio di montone era stabile e affidabile, con una buona ripetibilità. Ad una certa dose, l'estratto acquoso di EF era tossico per lo sviluppo di embrioni di zebrafish e la tossicità era più forte per il farmaco grezzo che per il farmaco trasformato. I risultati hanno mostrato che la lavorazione dell'olio di montone ha ridotto la tossicità dell'EF grezzo. Questi risultati possono essere utilizzati per migliorare la qualità, l'uniformità e la sicurezza clinica dell'EF trattato con olio di montone.

Risultati dell'indagine metodologica È stata osservata una relazione lineare tra la concentrazione di icariina, EA, EB, EC, BI e le aree di picco cromatografiche (vedere Tabella 3). I valori RSD% (n = 6) delle aree di picco cromatografiche di icariina, EA, EB, EC e BI erano rispettivamente 0,28%, 1,22%, 0,65%, 1,67% e 1,06%, indicando che la precisione delle misurazioni HPLC era buona. I valori RSD% (n = 6) dei contenuti di icariina, EA, EB, EC e BI erano rispettivamente 1,59%, 1,46%...

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Optimization of the Epimedii Folium Mutton-Oil Processing Technology and Testing Its Effect on Zebrafish Embryonic Development

In questo protocollo, la tecnologia di lavorazione dell'olio di montone di Epimedii folium (EF) è stata ottimizzata applicando una metodologia sperimentale di superficie di progettazione-risposta Box-Behnken ed è stato studiato preliminarmente l'effetto dell'EF grezzo e ottimizzato estratto dall'acqua sullo sviluppo embrionale del pesce zebra.

Ottimizzazione della tecnologia di lavorazione dell'olio di montone Epimedii folium e test del suo effetto sullo sviluppo embrionale del pesce zebra

As a traditional Chinese medicine (TCM), Epimedii folium (EF) has a history in medicine and food that is &#62; 2,000 years old. Clinically, EF processed ...

In questo studio, abbiamo adottato un metodo di lavorazione ampiamente utilizzato e acquisito una tecnica persistente stabile e affidabile. Il risultato ha mostrato che la tossicità di Epimedii trasformati era ridotta. Il metodo della superficie di risposta richiede meno esperimenti e cicli più brevi, che non solo evitano i problemi esistenti nella statistica matematica tradizionale, ma aiutano anche gli utenti a selezionare le condizioni ottimali.Questo metodo può anche essere ampiamente utilizzato nell'industria chimica, nell'ingegneria biologica, nell'industria alimentare, nella preparazione della medicina cinese, nell'estrazione della medicina cinese e così via. Dopo aver preparato la soluzione ed eseguito la cromatografia, selezionare i parametri chiave nell'elaborazione EF, come la quantità di olio di montone, la temperatura dell'olio di montone e la temperatura di frittura come fattori influenti. Utilizza i punteggi completi dei contenuti icariin, EA, EB, EC e BI come indici di valutazione.Utilizza il software di analisi della superficie di risposta per progettare gli esperimenti sulla superficie di risposta di Box-Behnken, esplorare la superficie di risposta quadratica e costruire un modello polinomiale del secondo ordine. Selezionare il nuovo design Box-Behnken e impostare l'opzione dei fattori numerici su tre. Impostare i fattori A, B e C.Fare clic su continua, quindi impostare l'opzione delle risposte su uno e fare clic su continua per completare il progetto.Elaborare l'EF in base ai parametri specifici, ad esempio, per l'ordine numero uno, dove l'olio di montone raffinato come 15% volume per volume, quindi riscaldarlo a 50 gradi Celsius per fonderlo. Aggiungere l'EF grezzo al montone fuso. Soffriggere a fuoco delicato fino a quando non è uniformemente lucido, quindi rimuovere e raffreddare l'EF. Preparare le soluzioni di prova dei prodotti trasformati e analizzarle utilizzando HPLC come descritto nel manoscritto.Registrare i tempi di ritenzione e le aree di picco di ciascuna composizione chimica e calcolare il contenuto di icariina, EA, EB, EC e BI in ciascuna soluzione di prova rispetto a una curva standard esterna. Calcola i punteggi completi dei 17 gruppi sperimentali utilizzando la formula di calcolo del punteggio completo. Importare i risultati completi del punteggio per i 17 gruppi di esperimenti nel software di analisi dei dati per analizzare i dati sperimentali.Sotto gli elementi di valutazione, selezionare l'opzione di ordine del processo quadratico e l'opzione del tipo di modello polinomiale. La superficie di risposta della quantità di olio di montone e la temperatura di frittura erano più ripide rispetto agli altri fattori testati e le linee di contorno tendevano ad essere più ellittiche, indicando che l'interazione tra questi due fattori era più significativa delle interazioni tra altri fattori. Il cromatogramma HPLC della sostanza di riferimento mista, dei prodotti trasformati grezzi Epimedii Folium ed Epimedii Folium dimostra che il contenuto di BI nell'EF grezzo è basso, mentre aumenta dopo la lavorazione.Il gruppo grezzo mostra evidenti deformità spinali, curvatura del corpo, edema pericardico e deformazione epatica a 150 microgrammi per millilitro di concentrazione di farmaco, mentre tali cambiamenti erano rari nei pesci giovani nel gruppo trasformato. Tutti i pesci zebra nel gruppo di farmaci grezzi sono morti 24 ore dopo la somministrazione di 200 microgrammi per millilitro di farmaco, mentre la mortalità nel gruppo elaborato era solo del 6,67% La somministrazione di 200 microgrammi per millilitro di EF ha causato la morte di tutti i pesci zebra nel gruppo di farmaci grezzi dopo 72 ore, mentre nel gruppo elaborato, 500 microgrammi per millilitro di EF hanno causato la morte di tutti i pesci zebra. La concentrazione letale mediana dei due gruppi sperimentali a 72 ore dopo la fecondazione ha mostrato che la LC 50 era di 151,3 microgrammi per millilitro nel gruppo grezzo e 219,8 microgrammi per millilitro nel gruppo elaborato.La cosa più importante nell'esperimento è selezionare i fattori del metodo della superficie di risposta e determinare i parametri di questi fattori.

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