该协议是一种强大且具有成本效益的方法，可用于解决与气道上皮细胞在健康和疾病中的功能和作用相关的各种研究问题。这种技术的主要优点是它产生的细胞层很好地代表了人类上皮细胞层，包括粘液产生和睫状体活动。这种技术是通用的，可用于研究与疾病相关的侮辱或治疗。
首先，在10厘米的培养皿中用10毫升无菌PBS冲洗从人肺组织中分离的支气管环。用镊子握住戒指时，用小剪刀去除多余的结缔组织和血液残留物。将戒指切成两半，并将两半浸入含有普莫星的HBSS中的10毫升预热蛋白酶14溶液中，置于封闭的无菌容器中。
将支气管环片在 37 摄氏度下孵育两个小时。孵育后，将碎片转移到含有10毫升温PBS的培养皿中，并使用弯曲的镊子刮擦环的内部以获得细胞溶液。丢弃戒指。
将细胞溶液转移到50毫升管中，并加入温热的PBS以获得50毫升的最终体积。离心细胞溶液，并吸出上清液，然后将沉淀重新悬浮在10毫升温热的PBS中。用PBS将体积补足至50毫升，然后重复离心。
将沉淀重新悬浮在含有普莫辛的温热完全KSFM中。接下来，用每孔两毫升细胞悬液替换六孔板中的包衣溶液。让细胞生长直到达到80%至90%的汇合度，对于PBEC的冷冻保存，从孔中吸出培养基，每孔用两毫升温热的PBS洗涤细胞一次。
通过每孔加入 500 微升软胰蛋白酶来胰蛋白酶消化细胞，并在 37 摄氏度下孵育 5 至 10 分钟。旋转胰蛋白酶溶液，并通过轻轻敲击板释放细胞。将分离的细胞转移到含有大豆胰蛋白酶抑制剂的50毫升离心管中。
离心悬浮液，弃去上清液，然后将沉淀重新悬浮在10毫升含有青霉素和链霉素的KSFM中。在自动细胞计数器上计数细胞后，将细胞在冷冻培养基中重新悬浮至每毫升400， 000个细胞的浓度，并在冷冻管中加入一毫升该悬浮液。将小瓶转移到凉爽的细胞容器中，并将其置于零下80摄氏度。
24小时后，将小瓶转移到零下196摄氏度的液氮中长期储存。要涂覆T75细胞培养瓶，在PBS中加入10毫升包衣溶液，并盖紧盖子，然后将烧瓶置于37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中。第二天，用10毫升完整的KSFM替换烧瓶中的涂层溶液。
让培养基在培养箱中加热至 37 摄氏度，并稍微打开盖子让培养箱空气进入。在 37 摄氏度的珠浴中快速解冻冷冻保存的 PBEC。将冷冻管中的全部内容物添加到预热的T75烧瓶中，并将细胞均匀分布。
确保细胞牢固附着后，用10毫升新鲜温暖的完全KSFM替换培养基，并生长至达到80%至90%汇合度。通过每个插入物添加400微升包衣溶液来包被细胞培养插入物，并在37摄氏度下孵育过夜。通过加入两毫升软胰蛋白酶来胰蛋白酶消化烧瓶中的PBEC，并孵育5至10分钟。
通过旋转并轻轻敲击烧瓶来促进细胞分离。接下来，向烧瓶中加入四毫升大豆胰蛋白酶抑制剂，并将细胞悬液转移到25毫升管中。离心悬浮液并将沉淀重新悬浮在六毫升完全BD培养基中。
在自动细胞计数器上对细胞进行计数。涂布后，从嵌件中取出涂层溶液。用补充有一纳摩尔EC 23的完整BD培养基稀释细胞悬液，并在插入物的膜顶部加入500微升。
将1.5毫升完整的BD培养基加入插入物下方的孔中。当细胞准备好转移到气液界面或ALI时，从插入物和孔中取出培养基，并向孔中加入补充有50纳摩尔EC 23的新的完整BD培养基。每周更换三次孔中的培养基。
为了去除多余的粘液和细胞碎片，在插入物内细胞层的顶端侧轻轻加入200微升温热的PBS，并在37摄氏度下孵育10分钟。孵育后，吸出含有过量粘液和细胞碎片的PBS。测量TEER以评估ALI PBEC培养物的质量。
在七天时，细胞层的电阻高于300欧姆被认为是成功的培养。此外，在气液界面培养的第7天和第14天之间，供体间电阻的变异性随着时间的推移而降低，并且受到所用DMEM来源的显着影响。在ALI培养14天时观察到所有主要的不同细胞类型，如基底细胞、纤毛细胞、杯状细胞和俱乐部细胞，表达水平与供体有关。
在测试的不同浓度的EC 23中，在50纳摩尔处观察到最大TEER。视黄酸及其合成类似物EC 23的比较证实，纤毛细胞和杯状细胞标记物的基因表达在50纳摩尔EC 23和视黄酸之间相似。使用来自不同供应商的培养基导致细胞组成存在实质性差异，而TEER的差异则不那么明显。
另一方面，使用来自不同供应商的插入物不会导致细胞分解的实质性差异。此外，还观察到ALI PBEC和PneumaCult培养基的TEER值和细胞组成与完全BD培养基相比存在差异。当细胞准备转移到ALI时，增加EC 23浓度。
另外，解冻后不要离心细胞，加入SBTI后迅速从细胞培养塑料中取出细胞。使用本协议中提供的方式进行气道上皮细胞培养，您可以使用各种分析方法来查看气道上皮细胞的功能、基因表达、介质产生，从而深入了解例如暴露于香烟烟雾的后果。该细胞培养方案的下一步是整合其他细胞类型，例如免疫细胞或血管细胞，这将有助于增加组织代表性。
