1.4K Views
•
08:42 min
•
May 26th, 2023
DOI :
May 26th, 2023
•0:04
Introduction
0:47
Isolation of Bronchial Epithelial Cells from Human Lung Tissue
2:17
Cryopreservation of Human Primary Bronchial Epithelial Cells (PBECs)
3:28
Thawing Cryopreserved PBECs and Growing Them for Culture on Inserts
4:23
Establishing an Air‐Liquid Interface Culture with Primary Bronchial Epithelial Cells (ALI‐PBEC)
6:03
Results: Characterization of ALI Cultures Using Cell‐Specific Marker Genes
7:41
Conclusion
Transcript
Detta protokoll är för en robust och kostnadseffektiv metod som kan användas för att ta itu med en mängd olika forskningsfrågor relaterade till luftvägsepitelcellernas funktion och roll för hälsa och sjukdom. Den största fördelen med denna teknik är att den resulterar i ett cellskikt som är en bra representation av det mänskliga epitelcellskiktet, inklusive slemproduktion och ciliär aktivitet. Denna teknik är mångsidig och kan användas för att studera sjukdomsrelaterade förolämpningar eller terapier.
För att börja, skölj bronkialringen isolerad från mänsklig lungvävnad med 10 ml steril PBS i en 10 centimeter petriskål. Medan du håller ringen med pincett, använd en liten sax för att ta bort överflödig bindväv och blodrester. Skär ringen i två och sänk ner två halvor i 10 ml förvärmd Protease 14-lösning i HBSS innehållande Primocin i en sluten steril behållare.
Inkubera bronkialringbitarna vid 37 grader Celsius i två timmar. Efter inkubation, överför bitarna till en petriskål innehållande 10 ml varm PBS och skrapa insidan av ringen med böjd pincett för att erhålla en celllösning. Kassera ringen.
Överför celllösningen till ett 50 ml rör och tillsätt varm PBS för att erhålla en slutlig volym på 50 ml. Centrifugera celllösningen och aspirera supernatanten innan du återsuspenderar pelleten i 10 ml varm PBS. Fyll på PBS till 50 ml och upprepa centrifugeringen.
Återsuspendera pelleten i varm komplett KSFM innehållande Primocin. Byt sedan ut beläggningslösningen från sexbrunnsplattan med två milliliter cellsuspension per brunn. Låt cellerna växa tills 80 till 90% sammanflöde uppnås, För kryokonservering av PBECs, aspirera mediet från brunnarna och tvätta cellerna en gång med två milliliter varm PBS per brunn.
Trypsinisera cellerna genom att tillsätta 500 mikroliter mjukt trypsin per brunn och inkubera i fem till 10 minuter vid 37 grader Celsius. Virvla trypsinlösningen och släpp cellerna genom att försiktigt knacka på plattan. Överför de fristående cellerna till ett 50 ml centrifugrör innehållande sojaböntrypsinhämmare.
Centrifugera suspensionen och kassera supernatanten innan pelleten suspenderas igen i 10 ml KSFM innehållande penicillin och streptomycin. Efter att ha räknat cellerna på en automatiserad cellräknare, suspendera cellerna till en koncentration av 400 000 celler per milliliter i ett frysmedium och tillsätt en milliliter av denna suspension i en kryovial. Överför injektionsflaskorna till en sval cellbehållare och placera den på minus 80 grader Celsius.
Efter 24 timmar, överför injektionsflaskorna till minus 196 grader Celsius flytande kväve för långtidsförvaring. För att belägga en T75-cellodlingskolv, tillsätt 10 ml beläggningslösning i PBS och stäng locket ordentligt innan kolven placeras i en inkubator vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Nästa dag, byt ut beläggningslösningen från kolven med 10 ml komplett KSFM.
Låt mediet värmas till 37 grader Celsius i inkubatorn med ett något öppnat lock för att låta inkubatorn lufta in. Tina snabbt de kryokonserverade PBEC: erna i ett 37 grader Celsius pärlbad. Tillsätt hela innehållet i kryovialen till den förvärmda T75-kolven och fördela cellerna jämnt.
Efter att ha säkerställt att cellerna är ordentligt fastsatta, byt ut mediet med 10 ml färsk och varm komplett KSFM och odla dem tills 80 till 90% sammanflöde uppnås. Beläggningscellodling sätts in genom att tillsätta 400 mikroliter beläggningslösning per insats och inkubera över natten vid 37 grader Celsius. Trypsinisera PBECs i kolven genom att tillsätta två ml mjukt trypsin och inkubera i fem till 10 minuter.
Underlätta celllossningen genom att virvla och försiktigt knacka på kolven. Tillsätt sedan fyra ml sojaböntrypsinhämmare till kolven och överför cellsuspensionen till ett 25 ml rör. Centrifugera suspensionen och suspendera pelleten igen i sex milliliter komplett BD-medium.
Räkna cellerna på en automatiserad cellräknare. Efter beläggning, ta bort beläggningslösningen från insatserna. Späd cellsuspensionen med komplett BD-medium kompletterat med en nanomol EC 23 och tillsätt 500 mikroliter på toppen av skärets membran.
Tillsätt 1,5 ml komplett BD-medium till brunnen under skäret. När cellerna är klara för överföring till Air-Liquid Interface, eller ALI, ta bort mediet från insatserna och brunnen och tillsätt nytt komplett BD-medium kompletterat med 50 nanomolar EC 23 endast till brunnen. Byt medium i brunnarna tre gånger i veckan.
För att avlägsna överskott av slem och cellulärt skräp, tillsätt försiktigt 200 mikroliter varm PBS på den apikala sidan av cellskiktet inuti insatsen och inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter. Efter inkubation, aspirera PBS som innehåller överskott av slem och cellulärt skräp. TEER mättes för att bedöma kvaliteten på ALI PBEC-kulturer.
Vid sju dagar anses det elektriska motståndet hos cellskiktet högre än 300 ohm vara en framgångsrik kultur. Vidare minskade variabiliteten mellan givarna i det elektriska motståndet över tid mellan dag sju och dag 14 av kulturen vid luft-vätskegränssnittet och påverkas markant av ursprunget till DMEM som används. Alla de stora olika celltyperna, såsom basala, cilierade, bägare och klubbceller, observerades vid 14 dagars ALI-odling, och uttrycksnivåerna var givarberoende.
Bland de olika koncentrationerna av testad EC 23 observerades maximal TEER vid 50 nanomolar. En jämförelse av retinsyra och dess syntetiska analog, EC 23, bekräftar att genuttrycket av markörer för cilierade och bägarceller var liknande mellan 50 nanomolar EC 23 och retinsyra. Användning av medium från olika leverantörer resulterade i väsentliga skillnader i cellulär sammansättning, medan skillnader i TEER var mindre uttalade.
Å andra sidan resulterade användningen av insatser från olika leverantörer inte i väsentliga skillnader i cellulär sönderdelning. Dessutom observerades också en skillnad i TEER-värden och cellulär sammansättning av ALI PBEC och PneumaCult-mediet jämfört med det fullständiga BD-mediet. När cellerna är redo att överföras till ALI, öka EC 23-koncentrationerna.
Centrifugera inte cellerna efter upptining och ta snabbt bort cellerna från cellodlingsplast efter tillsats av SBTI. Med hjälp av kulturer av luftvägsepitelceller på det sätt som anges i detta protokoll kan man följa upp det med hjälp av olika analysmetoder för att titta på till exempel luftvägsepitelcellernas funktion, genuttryck, mediatorproduktion och på så sätt till exempel få insikt i konsekvenserna av exponering för till exempel cigarettrök. Nästa steg för detta cellodlingsprotokoll är integrationen av ytterligare celltyper, såsom immunceller eller vaskulära celler, och detta kommer att bidra till att öka vävnadsrepresentationen.
Här presenteras en reproducerbar, prisvärd och robust metod för isolering och expansion av primära bronkialepitelceller för långsiktig biobankning och generering av differentierade epitelceller genom odling vid luft-vätskegränssnittet.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved