Name: isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy
Uploaded: 2023-02-03T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy at JoVE.com

Forfatterne har ingen anerkendelser.

hASC'er blev isoleret fra det abdominale fedtvæv hos en sund kvinde, der gennemgik brystrekonstruktion ved hjælp af abdominale autologe klapper (dybe inferiole epigastriske perforatorklapper, [DIEP]) på universitetshospitalet i Lausanne, CHUV, Lausanne, Schweiz. Den kasserede del af klappen og fedtvævet blev opnået, efter at patienten underskrev informeret samtykke. Alle protokoller blev gennemgået og godkendt af hospitalets Biobank Department DAL (nummer 314 GGC) og etiske komitéer i overensstemmelse med Helsingf...

<ol>
	<li>Naderi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+role+of+adipose-derived+stem+cells+(ADSC)+in+plastic+and+reconstructive+surgery.">The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery.</a> International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).</li><li>Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+human+platelet+lysate+(hPL)+the+ideal+candidate+to+substitute+the+foetal+bovine+serum+for+cell-therapy+translational+research.">Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).</li><li>Cond&#233;-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+mechanical+isolation+of+adipose-derived+stromal+vascular+fraction:+Review+of+upcoming+techniques.">Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+Implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Fadel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+obtainment+and+isolation+of+two+mesenchymal+stem+cell+sources+in+sheep.">Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep.</a> Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+A+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Cond&#233;-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).</li><li>Lalu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+cell+therapy+with+mesenchymal+stromal+cells+(SafeCell):+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+trials.">Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials.</a> PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).</li><li>Escobar, C. H., Chaparro, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+extraction,+culture,+and+cryopreservation+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).</li><li>Vaidya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet-C+irradiation+for+inactivation+of+viruses+in+foetal+bovine+serum.">Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum.</a> Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).</li><li>Kyll&#246;nen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+serum+conditions+on+osteogenic+differentiation+of+human+adipose+stem+cells+in+vitro.">Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (1), 17 (2013).</li><li>Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+quality+requirements+of+human+platelet+lysate:+A+position+statement+from+the+Working+Party+on+Cellular+Therapies+of+the+International+Society+of+Blood+Transfusion.">Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion.</a> Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+to+substitute+fetal+bovine+serum+in+hMSC+expansion+for+translational+applications:+A+systematic+review.">Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review.</a> Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+acts+synergistically+with+laminin+to+improve+the+neurotrophic+effect+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+primary+neurons.">Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+functional+substitute+for+fetal+bovine+serum+in+the+culture+of+human+adipose+derived+stromal/stem+cells.">Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+and+prevention+of+graft-versus-host+disease:+Experiments+and+practice.">Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice.</a> Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+metal+micro+and+nano-particles+on+hASCs:+An+in+vitro+model.">Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model.</a> Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).</li><li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stromal+vascular+fraction+cells:+Update+on+clinical+utility+and+efficacy.">Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).</li><li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+medium+composition+and+translational+adult+bone+marrow-derived+stem+cell+research.">Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research.</a> Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).</li><li>Perez-Ilzarbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ex+vivo+expansion+culture+conditions+of+mesenchymal+stem+cells+for+human+cell+therapy.">Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy.</a> Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Becherucci, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+in+mesenchymal+stromal+cell+expansion+according+to+a+GMP+grade+protocol:+A+cell+factory+experience.">Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 124 (2018).</li><li>Blande, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+mesenchymal+stem+cell+expansion+in+animal+serum-free+medium+supplemented+with+autologous+human+platelet+lysate.">Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate.</a> Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).</li><li>Castegnaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+platelet+lysate+on+the+functional+and+molecular+characteristics+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+tissue.">Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+and+meta-analysis+on+the+use+of+human+platelet+lysate+for+mesenchymal+stem+cell+cultures:+Comparison+with+fetal+bovine+serum+and+considerations+on+the+production+protocol.">Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 13 (1), 142 (2022).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+potential+clinical-translatable+supplement+to+support+the+neurotrophic+properties+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 432 (2020).</li><li>Kr&#228;henb&#252;hl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adipose-derived+stem+cell+expansion+and+stability+for+clinical+use.">Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use.</a> International Journal of Stem Cell Research &amp; Therapy. 2 (1), 007 (2015).</li></ol>

Fedtafledte stamceller har tiltrukket sig interesse for translationel forskning i det sidste årti på grund af deres overflod, hurtige og overkommelige isolationsmetoder, høj in vitro / in vivo spredningshastighed og stamme / differentieringsegenskaber18,19,20. Som følge heraf betragtes hASC'er som en fremragende kandidat til cellebaserede strategier inden for regenerativ medicin21. E...

I de seneste årtier har den stigende efterspørgsel efter innovative terapeutiske behandlinger givet anledning til betydelige bestræbelser og ressourceinvesteringer inden for translationel medicin1. Cellebaserede produkter er forbundet med risici bestemt af cellekilden, fremstillingsprocessen (isolering, ekspansion eller genetisk modifikation) og de ikke-cellulære kosttilskud (enzymer, vækstfaktorer, kulturtilskud og antibiotika), og disse risikofaktorer afhænger af den specifikke terapeutiske indikation. Slutproduktets kvalitet, sikkerhed og effektivitet kan påvirkes dybt af ovennævnte elementer2. Stamcelleterapi kræver overholdelse af biosikkerhedsprincipper; De potentielle risici for patogen overførsel med animalske produkter i cellekultur kan være problematiske, og grundig testning af ethvert produkt, der introduceres i fremstillingen, er afgørende3.
Den traditionelle metode til isolering af humane fedtafledte stamceller (hASC'er) involverer en enzymatisk fordøjelse udført med kollagenase efterfulgt af vasketrin gennem centrifugering4. Mens enzymatisk isolering generelt betragtes som mere effektiv end andre mekaniske teknikker med hensyn til celleudbytter og levedygtighed, betragtes de anvendte animalske afledte komponenter, såsom collagenase, som mere end minimalt manipuleret af US Food and Drug Administration. Dette betyder, at der er en signifikant øget risiko for immunreaktioner eller sygdomsoverførsel, hvilket begrænser oversættelsen af hASC-behandling til kliniske indstillinger 5,6.
Trypsin-baseret fordøjelse er en anden enzymatisk protokol til at isolere ASC'er. Forskellige teknikker er blevet beskrevet med små ændringer med hensyn til trypsinkoncentration, centrifugeringshastighed og inkubationstid. Desværre er denne metode ikke godt beskrevet, og der mangler sammenligning i litteraturen, især med de mekaniske isolationsprotokoller7. Med hensyn til oversætteligheden af tilgangen har trypsin imidlertid de samme ulemper ved collagenase.
Alternative isolationsmetoder til opnåelse af ASC'er, baseret på mekaniske kræfter og uden enzymtilsætning, involverer højhastighedscentrifugering (800 x g eller 1.280 x g, 15 min) af fedtvævsfragmenterne. Derefter inkuberes pelleten med en røde blodlegemer lysebuffer (5 min) efterfulgt af et andet centrifugeringstrin ved 600 x g før resuspension i dyrkningsmedium. På trods af at et større antal celler blev isoleret i de første dage sammenlignet med explant-metoderne, viste en tidligere undersøgelse lavere eller fraværende spredning ud over den anden uge af kultur8.
Derudover er yderligere manipulation med xenogent tilsat medium, såsom føtalt bovint serum (FBS), der bruges som vækstfaktortilskud til cellekultur, forbundet med en øget risiko for immunreaktivitet og eksponering for virale, bakterielle eller prioninfektioner hos værtspatienten 9,10. Immunreaktioner og udvikling af urticariform udslæt er allerede beskrevet hos personer, der får flere doser mesenkymale stamceller produceret med FBS11. Desuden udsættes FBS for batch-til-batch-variabilitet, hvilket kan have indflydelse på den endelige produktkvalitet12.
I overensstemmelse med god fremstillingspraksis (GMP) retningslinjer, enzymatisk væv dissociation bør undgås, og FBS bør erstattes med xenogen-fri kosttilskud. Disse trin er sammen med mere pålidelige og reproducerbare protokoller afgørende for at understøtte anvendelsen af celleterapi 3,13.
I denne sammenhæng er humant blodpladelysat (hPL) blevet foreslået som erstatning for FBS, da det er et cellefrit, proteinholdigt, vækstfaktorberiget supplement, og det blev tidligere introduceret blandt cellebaserede produkter af klinisk kvalitet som et tilsætningsstof til vækstmedium til in vitro-cellekultur og ekspansion14,15. Da hPL er et humant afledt produkt, anvendes det ofte som erstatning for FBS under in vitro-kulturen af hASC'er beregnet til kliniske anvendelser, hvilket reducerer problemer vedrørende immunologiske reaktioner og infektioner relateret til FBS-oversættelighed15,16.
På trods af de højere produktionsomkostninger er det allerede blevet påvist, at hPL sammenlignet med FBS understøtter cellelevedygtighed for mange celletyper, øger spredning, forsinker ældning, sikrer genomisk stabilitet og bevarer den cellulære immunofænotype selv i sene cellepassager; Alle disse elementer understøtter skiftet til dette kulturtillæg11.
Formålet med dette arbejde var at udvikle en standardiseret protokol til isolering og dyrkning af hASC'er med en komplet dyrefri metode uden at ændre cellefysiologien og stamhedsegenskaberne sammenlignet med klassiske FBS-dyrkede hASC'er (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>euroclone</td>
			<td>et5015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD105</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD560839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD73</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD561254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)</td>
			<td>BD accuri</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Blaubrand</td>
			<td>717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container</td>
			<td>corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell Freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>clearline</td>
			<td>390701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposabile blade scalpel</td>
			<td>paragon</td>
			<td>bs 2982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Platelet Lysate FD (GMP grade)</td>
			<td>Stemulate</td>
			<td>PL-NH-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite F50 spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 10 cm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels</td>
			<td>Reda</td>
			<td>07104-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>4071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezers</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>6910170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLe (animal free trypsin substitute)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy

I betragtning af den stigende virkning af stamcelleterapi er der blevet rejst biosikkerhedsmæssige betænkeligheder med hensyn til potentiel kontaminering eller infektionsoverførsel som følge af indførelsen af animalske produkter under in vitro-manipulation . De xenogene komponenter, såsom kollagenase eller føtalt bovint serum, der almindeligvis anvendes under celleisolations- og ekspansionstrinnene, kan være forbundet med de potentielle risici for immunreaktivitet eller virus-, bakterie- og prioninfektion hos de modtagende patienter. Efter retningslinjer for god fremstillingspraksis bør kemisk vævsdissociation undgås, mens føtalt bovint serum (FBS) kan erstattes med xenogenfrie kosttilskud. For at sikre celleprodukternes sikkerhed er det desuden vigtigt at definere mere pålidelige og reproducerbare metoder. Vi har udviklet en innovativ, fuldstændig xenogen-fri metode til isolering og in vitro ekspansion af humane fedtafledte stamceller uden at ændre deres egenskaber sammenlignet med collagenase FBS-dyrkede standardprotokoller. Her blev humane fedtafledte stamceller (hASC'er) isoleret fra abdominalt fedtvæv. Prøven blev mekanisk hakket med en saks/en skalpel, mikrodissekeret og mekanisk dispergeret i en 10 cm petriskål og forberedt med skalpelsnit for at lette fastgørelsen af vævsfragmenterne og migrationen af hASC'er. Efter vasketrinnene blev hASC'er valgt på grund af deres plastiske vedhæftning uden enzymatisk fordøjelse. De isolerede hASC'er blev dyrket med medium suppleret med 5% heparinfrit humant blodpladelysat og løsrevet med en dyrefri trypsinerstatning. I overensstemmelse med god fremstillingspraksis (GMP) anvisninger om produktion af celleprodukter beregnet til human terapi blev der ikke anvendt antibiotika i nogen kulturmedier.

Ved anvendelse af isolationsmetoden beskrevet ovenfor blev hASC'er med succes opnået fra abdominale fedtvævsprøver uden brug af collagenase. Desuden blev hASC'erne udvidet under fuldstændig xenogenfrie forhold under tilstedeværelse af hPL og uden andre komponenter af animalsk oprindelse. Følgende resultater understøtter protokollen og opnås fra hASC'er dyrket parallelt med hPL og med FBS som kontrolbetingelse.
Efter det første klyngeudseende viste hASC'erne den klassiske spindellignen...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy at JoVE.com

Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

Xenogene (kemiske eller animalsk afledte) produkter, der introduceres i celleterapiforberedelses-/manipulationstrinnene, er forbundet med en øget risiko for immunreaktivitet og patogen overførsel hos værtspatienter. Her beskrives en komplet xenogenfri metode til isolering og in vitro-ekspansion af humane fedtafledte stamceller.

Isolering og dyrkning af humane fedtafledte stamceller med en innovativ xenogenfri metode til human terapi

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

Vores eksogene metode til isolering og in vitro-udvidelse af humane fedtafledte stamceller er svaret på biosikkerhedsproblemerne omkring celleterapi, når det overvejes til translationel anvendelse. Vores isolerings- og udvidelsesmetoder er enkle at replikere, hurtige og lave tekniske krav, hvilket gør dem nyttige for alle. Vi undersøger human fedtstamcellebaseret terapistrategi til reparation af perifere nerver.Vores teknik kan dog anvendes bredt, når der er behov for nye fedtstamceller i forskellige kliniske forskningsopsætninger. Vi holdt det enkelt at spare lettere producerbarhed. Sterilitet skal observeres nøje fra operationsstuen til cellekultur.Ved prøvemanipulation og fragmenter er mikrodissektion i risiko for kontaminering. Efter at have opnået fedtvævsprøven fra abdominal plastikkirurgi ved hjælp af steril saks, skæres den i stykker på ca. en kvadratcentimeter. Med en skalpel mikrodissekeres hvert stykke i mindre fragmenter og spredes fem fragmenter i en 10 centimeter petriskål.Til fragmentfastgørelse skal du bruge en skalpel til at skabe snit på plastoverfladen og trække hvert fragment. Tilsæt forsigtigt 10 ml komplet kulturmedium for at dække alle fragmenterne uden at løsne dem og inkuber petriskålen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Overvåg den humane fedtafledte stamcelle, eller HASC, ekspansion dagligt under et optisk mikroskop, indtil cellerne bliver sammenflydende.Udskift mediet med et friskt, komplet medium hver 72. time for at fjerne cellerester og lad dem vokse indtil den første passage. Når HESC-kulturen når 70 til 80% sammenløb, skal du fjerne og kassere alle vævsstykker ved hjælp af steril pincet. Kassér også det udmattede medium, og undgå HASC's løsrivelse fra petriskålen.Vask forsigtigt cellerne med 10 ml PBS. Efter fjernelse af PBS tilsættes en milliliter dyrefri trypsin og inkuberes ved 37 grader Celsius i fem minutter. Kontroller for celleløsning under et optisk mikroskop og inkuber i yderligere to minutter, hvis det kræves.For at understøtte celleløsningen skal du forsigtigt trykke på plastoverfladen. Stop trypsinvirkningen ved at tilføje to milliliter komplet medium og saml alle cellerne i et 15 ml rør. Fjern det resterende trypsin ved centrifugering.Efter at supernatanten er kasseret, opslæmmes cellerne i fem ml komplet substrat, og cellesuspensionen overføres til en ny T25-kolbe. Til kryokonservering tælles en delprøve løsrevne løsrevne celler ved hjælp af celletælleren under et optisk mikroskop. Centrifuger cellerne ved 300 G i fem minutter.Efter at supernatanten er kasseret, suspenderes cellerne i fryseblandingen med en massefylde på 1 gange 10 til de sjette blodlegemer pr. ml, og en milliliter af cellesuspensionen overføres til et hætteglas med kryo. Sæt cryohætteglassene ved minus 80 grader Celsius i en frysebeholder, der sænker temperaturen med en grad Celsius pr. minut, og flyt derefter cryohætteglassene til flydende nitrogen til langtidsopbevaring. I det oprindelige klyngeudseende viste HASC'erne en klassisk spindellignende form og var mindre såvel som mere langstrakte sammenlignet med kontrolcellerne i nærværelse af FBS.Celleimmunofænotypen syntes at være ens mellem HASC'erne dyrket med de to kosttilskud. Mere end 80-90 % af ASC'erne var positive for CD73 og CD105 og mindre end 5 % for CD34 og CD45. Endelig afslørede proliferationsanalysen en signifikant stigning i cellevækst, når humant blodpladelysat blev tilsat til mediet sammenlignet med FBS-kontrollen.Det vigtigste trin er mikrodissektion af fedtfragmenter og deres fastgørelse med skalpelsnit på petriskål. En brugsklar human fedtafledt stamcellepopulation opnås med hensyn til GMP-biosikkerhedskriterierne, idet terapeutiske celleegenskaber bevares og celleproliferation forbedres.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamcelletransplantation i en In vitro Simuleret Iskæmi / reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering af cardiomyocyte Kerner fra Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Subretinal injektion af genterapivektorer og stamceller i mus Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, karakterisering og sammenlignende differentiering af humane Dental Pulp stamceller fra blivende tænder ved hjælp af to forskellige metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolation, Kultur og Imaging for Human Føtal pankreascelle Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering af kræft stamceller fra humane Prostata Cancer Prøver

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolation, Kryopræservering og dyrkning af humane amnion epitelceller ved kliniske anvendelser

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

En roman kliniske Grade Isolation metode for menneskelige nyre Perivascular stromale celler

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and ...

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

Isolering af fedtafledte regenerative celler til behandling af erektil dysfunktion efter radikal prostatektomi

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

En enzym-fri metode til isolering og udvidelse af humane Adipose-afledte mesenchymale stamceller

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...