Name: measuring the rate of lipolysis in ex vivo murine adipose tissue and primary preadipocytes differentiated in vitro
Uploaded: 2023-03-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro at JoVE.com

Detta arbete stöddes av US National Institutes of Health-bidraget R01DK126944 till S.M.R.

Användningen av alla djur godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Weill Cornell Medical College of Cornell University.
1. Förberedelse av buffertar och uppsamlingsplattor
<ol><li>Gör 5% bovint serumalbumin (BSA) genom att lösa upp 5 g BSA i 100 ml Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) utan fenolrött. Rör försiktigt BSA för att lösa upp (skakning är kontraproduktivt). När BSA är helt upplöst, filtersterilisera mediet med ett 0,...

Här tillhandahåller vi ett grundläggande protokoll för att mäta lipolyshastigheten i adipocyter och ex vivo fettvävnad. För att kvantifiera lipolys är det viktigt att mäta lipolytisk hastighet i den linjära fasen. Vi använder en seriell provtagningsteknik, där en stor del av media samlas in och ersätts med färska medier med jämna mellanrum. Denna semikonservativa metod möjliggör tillsats av färsk BSA med FFA-buffertkapacitet och fördröjer återkopplingshämning, vilket förlänger varaktighet...

Överskott av näringsämnen lagras i vit fettvävnad i form av triglycerider i den neutrala lipidkärnan i lipiddroppar. Triglyceridförråd mobiliseras via lipolys, en process genom vilken fettsyrasidokedjorna klyvs sekventiellt av fettvävnad triglyceridlipas (ATGL), hormonkänsligt lipas (HSL) och monoglyceridlipas (MGL), vilket resulterar i frisättning av fria fettsyror (FFA) och glycerolryggraden 1,2. Lipolys aktiveras genom katekolaminsignalering i fettvävnaden. Sympatiska nervterminaler frisätter lokalt katekolaminer, som binder till β-adrenerga receptorer på adipocytplasmamembranet. Vid ligandbindning aktiverar dessa G-proteinkopplade receptorer (GPCR) adenylylcyklas via Gαs. Efterföljande aktivering av proteinkinas A (PKA) av cAMP resulterar i uppreglering av både ATGL och HSL. Fosforyleringen av perilipin-1 av PKA orsakar dissociation av ABHD5 (även känd som CGI-58), som binder och samaktiverar ATGL3. PKA fosforylerar HSL direkt, vilket främjar dess translokation från cytosolen till lipiddroppen, där interaktion med fosforylerad perilipin-1 ytterligare främjar dess lipasaktivitet 4,5,6,7. Det tredje lipaset som är involverat i lipolys, MGL, verkar inte regleras av katekolaminsignalering8. Viktigt är att triglyceridsyntes i adipocyter medieras av glycerollipidsyntesvägen, som inte involverar bildandet av monoglycerider som mellanprodukt; istället katalyserar glycerol-3-fosfatacyltransferaser bildningen av lysofosfatidinsyra, som kombineras med en annan fettacyl-CoA för att bilda fosfatidinsyra och sedan isomeriseras till diglycerider före den slutliga syntesen av triglycerider (figur 1) 9,10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65106/65106fig01.jpg"> Figur 1: Lipolys och glycerol lipidsyntesvägar. Överst: Lipolytisk väg; enzymer som visas i rött: fettvävnad triglyceridlipas (ATGL), hormonkänsligt lipas (HSL) och monoglyceridlipas (MGL). Botten: glycerol lipid syntes väg; enzymer som visas i grönt: diglyceridacyltransferas (DGAT), fosfatidsyrafosfatas (PAP), lysofosfatidsyraacyltransferas (LPAT, även känt som LPAAT) och glycerol-3-fosfatacyltransferas (GPAT). Lipider: triglycerid (TG), diglycerid (DG), monoglycerid (MG), fri fettsyra (FFA), fettacyl-CoA (FA-CoA), lysofosfatidinsyra (LPA) och fosfatidinsyra (PA). Andra metaboliter: oorganiskt fosfat (Pi) och glycerol-3-fosfat (G3P). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65106/65106fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Extracellulär adenosin är en annan viktig regulator för lipolys, som arbetar genom Gs- och Gi-kopplade GPCR för att påverka adenylcyklasaktivitet. Den dominerande adenosinreceptorn i adipocyter, ADORA1, hämmar adenylylcyklas och därmed lipolys genom aktivering av Gi12. ADORA2A uttrycks vid lägre nivåer, och främst i bruna adipocyter, och aktiverar lipolys via G s-signalering13. ADORA1 påverkar både basal lipolys och svaret på adrenerga agonister. Effekten av adenosin på lipolys kan kontrolleras genom tillsats av adenosindeaminas för att neutralisera adenosin, liksom ADORA1-specifik agonist fenylisopropyladenosin14,15. Hormonell aktivering av Gq-kopplade GPCR kan också påverka lipolys via aktivering av fosfolipas C och proteinkinas C16,17,18,19. Inflammatoriska signaler påverkar också lipolytiska hastigheter. TLR4-aktivering av LPS (och andra endotoxiner) ökar den lipolytiska hastigheten genom att aktivera ERK, som fosforylerar perilipin-1 och HSL20. TNF-α aktiverar också lipolys via ERK- och NF-κB-aktivering, samt transkriptionell nedreglering av fosfodiesteras PDE-3B och CIDEC21,22,23. IL-6 har också associerats med ökad adipocytlipolys, särskilt i mesenterisk fettvävnad, vars FFA-frisättning påverkar leversteatos och glukoneogenes24,25,26.
Lipolys undertrycks under matningstillståndet av insulin. AKT fosforylerar och aktiverar PDE-3B för att undertrycka cAMP-signalering och förhindra PKA-aktivering27. Insulin nedreglerar också ATGL28 via transkription. Fetma främjar katekolaminresistens genom en mängd olika mekanismer, inklusive nedreglering av β-adrenerga receptorer i adipocyter 29,30,31,32,33. Adipocyter uttrycker alla tre β-adrenerga receptorer (β-1, β-2 och β-3). Medan β-1 och β-2 adrenerga receptorer uttrycks allestädes närvarande, uttrycks β-3-adrenerga receptorn huvudsakligen i adipocyter hos möss34,35. Adrb3-uttryck induceras av C / EBPα under adipogenesis36. Den β-3 adrenerga receptorn uttrycks starkt i mogna adipocyter. Aktiveringen av β-1 och β-2 adrenerga receptorer är självbegränsande på grund av återkopplingshämning av β-arrestin37. Återkopplingshämning av β-3-adrenerga receptorn medieras av andra signalvägar, vilket minskar Adrb3-uttrycket 33,38,39.
Många föreningar kan användas för att aktivera adipocytlipolys. Katekolaminer är viktiga fysiologiska aktivatorer av lipolys. Noradrenalin (eller noradrenalin) och adrenalin (eller adrenalin) aktiverar alla tre β-adrenerga receptorer40. Noradrenalin och adrenalin påverkar också lipolys via aktivering av α-adrenerg receptorsignalering41. Vanliga β-adrenerga receptoragonister inkluderar isoproterenol, som är en icke-selektiv β-adrenerg receptoragonist, och β-3-adrenerga receptoragonister CL-316,243 och mirabegron42. Med tanke på att adipocyter huvudsakligen uttrycker den β-3-adrenerga receptorn använder vi CL-316,243 som ett exempel här. Dess specificitet för β-3-adrenerga receptorn gör den också till en relativt specifik aktivator av adipocytkatekolaminsignalering, som också säkert kan användas in vivo. Observera att den vanliga koncentrationen av 10 μM CL-316,243 i cellodling är storleksordningar högre än den ~ 0,1 μM dos som krävs för att uppnå ett maximalt svar33. Forskolin kringgår adrenerga receptorn, direkt aktivera adenylylcyklas och nedströms lipolytisk signalering. Det finns många fler aktivatorer, liksom suppressorer av lipolys. Vid val av en förening för att stimulera lipolys bör receptorspecificiteten och nedströms signalvägar noggrant övervägas inom den experimentella designen.
Graden av lipolys i vit fettvävnad är en viktig metabolisk faktor som påverkar kalltolerans och näringstillgänglighet under fasta eller träning43,44,45,46. Syftet med detta protokoll är att mäta graden av lipolys i adipocyter och fettvävnad, vilket kommer att underlätta förståelsen av adipocytmetabolism och hur det kan påverka den metaboliska fenotypen av olika murina modeller. För att kvantifiera den lipolytiska hastigheten mäter vi utseendet på lipolytiska produkter i media (dvs FFA och glycerol). Metoden bygger på frisättning av lipolytiska produkter från adipocyten i media. Eftersom vita adipocyter uttrycker låga nivåer av glycerolkinas är glycerolåterupptagshastigheterna låga47. Omvänt bör produktion av FFA och glycerol genom andra metaboliska vägar än lipolys också övervägas. Adipocyter verkar uttrycka ett fosfatas med aktivitet mot glycerol-3-fosfat, vilket möjliggör produktion av glycerol från glycerol-3-fosfat härrörande från glukos48,49,50. Glykolys är en källa till glycerol-3-fosfat som används för FFA-reesterifiering i vita adipocyter. När glukosnivåerna är begränsade kräver glyceroneogenes andra 3-kolkällor, såsom laktat och pyruvat51. Kanaliseringen av FFA som frigörs genom lipolys i cellen och deras metaboliska öde är dåligt förstådd; FFA som frigörs genom lipolys måste omvandlas till fettacyl-CoA innan de förestras eller genomgår β-oxidation. Det verkar som om FFA som frigörs genom lipolys sannolikt lämnar cellen innan de tas upp igen och omvandlas till fettacyl-CoA 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFA kan sekvestreras utanför cellen med albumin. Viktigt är att långkedjiga FFA är kända för att återkopplingshämma lipolys om de inte sekvestreras av albumin 63,64,65,66,67. Således är optimering av medias FFA-buffertkapacitet under lipolysanalysen kritisk. Proceduren som beskrivs här liknar tidigare publicerade metoder för att mäta den lipolytiska hastigheten i adipocyter och ex vivo fettvävnad från möss och människor 15,68,69,70,71. Detta protokoll skiljer sig genom användning av seriell provtagning; Genom att utföra seriell provtagning kan vi internt validera att lipolys mäts i den linjära fasen och använda flera mätningar för att beräkna lipolyshastigheten, vilket minskar mätfelet för att öka förtroendet för det slutliga beräknade värdet. Nackdelen med seriell provtagning är att analysen kräver mer tid och reagens; Den längre tidsramen minskar dock mätfelets inverkan på standardfelet i uppskattningarna av frekvensen. Dessutom mäter detta protokoll både FFA- och glycerolfrisättning och beaktar förhållandet mellan FFA: glycerolfrisättning med målet att uppnå ett 3: 1-förhållande, vilket kan förväntas från fullständig lipolys och frisättning av lipolytiska produkter i media72.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-Well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>3527</td>
			<td>Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well flat bottom plate with lid</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>353078</td>
			<td>Can be tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well flat bottom plate with lid</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>353046</td>
			<td>Can be tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well PCR Plate</td>
			<td>USA sceintific</td>
			<td>1402-9100</td>
			<td>Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td>FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CL-316,243</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5976</td>
			<td>CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>PHCBI</td>
			<td>MCO-170AICUVH</td>
			<td>CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td>11054020</td>
			<td>Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFA-free Bovine serum albumin</td>
			<td>Equitech-Bio, Inc,&#160;</td>
			<td>BAH66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Glycerol Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol Standard Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7793&#160;</td>
			<td>This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HR Series NEFA Standard Solution</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>276-76491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>999-34691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>991-34891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HR Series NEFA-HR (2) Solvent A&#160;</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>995-34791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HR Series NEFA-HR (2) Solvent B&#160;</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>993-35191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>S28668</td>
			<td>Any incubator at 37C can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>269620</td>
			<td>Any optically clear, flat bottom 96-well plate works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Laboratory Benchtop Mat</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76045-300</td>
			<td>Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer/Microplate Reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>SpectraMax i3x&#160;</td>
			<td>Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>810531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WypAll X70 Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>41200</td>
			<td>Any high quality paper towel will work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the rate of lipolysis in ex vivo murine adipose tissue and primary preadipocytes differentiated in vitro

Adipocyter lagrar energi i form av triglycerider i lipiddroppar. Denna energi kan mobiliseras via lipolys, där fettsyrasidokedjorna klyvs sekventiellt från glycerolryggraden, vilket resulterar i frisättning av fria fettsyror och glycerol. På grund av det låga uttrycket av glycerolkinas i vita adipocyter är glycerolåterupptagshastigheterna försumbara, medan återupptaget av fettsyror dikteras av fettsyrabindningskapaciteten hos mediekomponenter såsom albumin. Både glycerol och fettsyrafrisättning i media kan kvantifieras med kolorimetriska analyser för att bestämma lipolytisk hastighet. Genom att mäta dessa faktorer vid flera tidpunkter kan man bestämma den linjära lipolyshastigheten med hög säkerhet. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för mätning av lipolys i in vitro-differentierade adipocyter och ex vivo fettvävnad från möss. Detta protokoll kan också optimeras för andra preadipocytcellinjer eller fettvävnad från andra organismer; Överväganden och optimeringsparametrar diskuteras. Detta protokoll är utformat för att vara användbart för att bestämma och jämföra graden av adipocytlipolys mellan musmodeller och behandlingar.

Vi mätte den basala och stimulerade lipolytiska hastigheten för in vitro differentierade adipocyter. Primära preadipocyter från vit fettvävnad differentierades till adipocyter genom behandling av konfluenta celler med 5 μM dexametason, 0,5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin och 1 μM troglitazon i 4 dagar, följt av ytterligare 3 dagars behandling med 1 μg/ml insulin. Cellerna inkuberades i media utan insulin i 24 timmar före lipolysanalysen. Vid tiden = 0h tvättades cellerna en gång med PBS, sedan tillsattes f...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro at JoVE.com

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Triglyceridlipolys i adipocyter är en viktig metabolisk process som resulterar i frigörelse av fria fettsyror och glycerol. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att mäta basal och stimulerad lipolys i adipocyter och ex vivo fettvävnad från möss.

Mätning av lipolyshastigheten i ex vivo murin fettvävnad och primära preadipocyter differentierade in vitro

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are ...

Detta protokoll beskriver bestämningen av graden av adipocytlipolys i odlade adipocyter eller ex vivo fettvävnad, vilket möjliggör jämförelse av lipolytiska hastigheter mellan murina modeller eller behandlingar. Detta protokoll använder seriell provtagning, vilket gör att man internt kan validera att lipolys mäts i den linjära fasen och minskar mätfelet. Med optimering kan detta protokoll användas för att mäta lipolys i brun fettvävnad, fettvävnad från andra organismer eller adipogenic cellinjer.Ex vivo-vävnader måste hackas i små bitar av jämn storlek och form för att möjliggöra bindning av de frigjorda fria fettsyrorna genom BSA i media. För att börja, förbered 5% BSA-mediet genom att lösa upp fem gram bovint serumalbumin, eller BSA, i 100 ml Dulbeccos modifierade örnmedium eller DMEM, utan fenolrött. Rör försiktigt om lösningen för att lösa upp BSA.Förbered sedan arbetskoncentrationer av kontroll- och stimuleringsmedier. Innan du använder, värm mediet till 37 grader Celsius. Märk en platta med 96 brunnar för medieinsamling.Inuti en steril dragskåp, utför isolering och differentiering av 100% konfluenta primära preadipocyter. Varannan till var tredje dag, byt odlingsmedia som innehåller insulin och behåll en volym på en milliliter per brunn. För denna studie, använd endast kulturer med differentieringshastigheter över 90% och liknande mellan grupper.Odla sedan cellerna i insulinfria medier i 24 timmar innan lipolys mäts. Tvätta cellerna med DPBS en gång för att avlägsna kvarvarande serum från odlingsmediet. Förbered en platta med 48 brunnar med en brunn för varje replikat.Placera 400 mikroliter rumstemperatur DMEM i varje brunn som ska användas. Använd två till fyra kontroller och två till fyra stimulerade brunnar per vävnad per mus. Förbered en sexbrunnsplatta med en brunn för varje vävnad som ska samlas in från varje mus och lägg fyra milliliter rumstemperatur DMEM i varje brunn som ska användas.Placera den uppsamlade gonadala fettvävnaden i sexbrunnsplattan. Ta bort vävnad från brunnen. Lägg den på en silikonmatta och skär den i fem till sju milligram bitar med sax.Torka vävnaderna på en ren handduk för att ta bort eventuella medier. Väg sedan 25 till 30 milligram, motsvarande fem eller sex vävnadsbitar, för varje analysbrunn och placera dem i den tidigare beredda 48-brunnsanalysplattan. Väg viktbåten efter att vävnaderna har tagits bort och registrera vikten av eventuella rester som finns kvar.Torka av viktbåten mellan proverna och riv igen vid behov. Använd en ny viktbåt för varje vävnad. När alla vävnadsprover har vägts, placera analysplattan med 48 brunnar i en 37 grader Celsius inkubator under 10% koldioxid i 15 minuter.Utför medieinsamling i en steril dragskåp. Vid tid noll, efter avlägsnande av mediet, tillsätt 400 mikroliter antingen kontroll- eller stimuleringsmedium per brunn och placera analysplattan i en inkubator vid 37 grader Celsius och 10% koldioxid. För vävnadsodling ex vivo, ta försiktigt bort media med en pipett och undvik att suga.Ibland en, två, tre och fyra timmar, samla 200 mikroliter media, ersätt det med 200 mikroliter av lämpligt kontroll- eller stimuleringsmedium och returnera analysplattan till inkubatorn. Förvara uppsamlingsplattan vid fyra grader Celsius. Tina och blanda proverna.Värm reagenserna till rumstemperatur och lös upp en flaska färgreagens A med en flaska lösningsmedel A och en flaska färgreagens B med en flaska lösningsmedel B.Efter att ha skapat en fri fettsyra- eller FFA-standardkurva, pipettstandarder och prover i en 96-brunns analysplatta. Den rekommenderade provvolymen är 10 mikroliter per brunn. Tillsätt 150 mikroliter reagens A till varje brunn och blanda.Inkubera analysplattan vid 37 grader Celsius i fem minuter. Läs plattans absorbans vid 550 nanometer och 660 nanometer och hänvisa till detta som att läsa A.Tillsätt 75 mikroliter reagens B till varje brunn och blanda. Inkubera analysplattan vid 37 grader Celsius i fem minuter.Sedan efter att ha tagit bort plattan från inkubatorn, läs plattans absorbans igen vid 550 och 660 nanometer. Se denna avläsning som läsning B.Rekonstituera det fria glycerolreagenset med 36 liter ultrarent vatten och acklimatisera det till rumstemperatur. Tina och blanda proverna.Skapa en glycerolstandardkurva genom att göra en 7,2-faldig serieutspädning av glycerolstandardlösningen och ett vattenämne. Pipettera 25 mikroliter av varje standard och prover i 96-brunnsanalysplattan. Tillsätt 175 mikroliter fritt glycerolreagens till varje brunn och blanda.Inkubera analysplattan vid 37 grader Celsius i fem minuter. Efter att ha tagit bort plattan från inkubatorn, läs plattans absorbans vid 540 nanometer. Följ stegen som beskrivs i texten för att beräkna de lipolytiska hastigheterna i respektive R-kvadratvärden.Använd sedan FFA- och glycerolproduktionshastigheterna för varje prov som en individuell datapunkt, utför statistisk analys och plotta värdena om olika lipolytiska hastigheter jämförs. Om lipolytiska ex vivo-frekvenser jämförs mellan genotyper, använd två eller tre prover per djur som tekniska replikat och använd genomsnittet för en datapunkt per djur så att provstorleken är lika med antalet djur. Utför sedan statistisk analys med data.FFA- och glycerolproduktionen i de in vitro-differentierade preadipocyterna var linjär under den fyra timmar långa analysen. De stimulerade lipolytiska hastigheterna var signifikant högre än basala priser. I stimulerade celler var FFA-till-glycerolmolförhållandet ungefär tre, vilket indikerar triglyceridlipolys utan signifikant återupptag eller retention.I de ostimulerade cellerna var förhållandet ungefär ett, vilket tyder på en icke-lipolytisk källa till glycerol. I ex vivo-kulturer uppvisade större vävnadsbitar med ett lägre förhållande mellan yta och volym högre FFA-retention, vilket resulterade i lägre FFA-till-glycerol-molförhållanden. I vävnadsbitarna på 25 milligram påverkade FFA-retentionen negativt lipolyshastigheterna.Mycket små vävnadsbitar uppvisade också reducerade lipolytiska hastigheter. Reduktion av BSA i media minskade signifikant både FFA- och glycerolfrisättningen. FFA-ackumuleringen i 5% BSA-mediet efter 24 timmars stimulering var fem millimolar medan 0,5% BSA-mediet endast var 0,6 millimolar.FFA-nivåerna i de insamlade medierna nådde riskzonen på 2,3 millimolar på tre timmar. Bristen på ökning av media FFA och glycerol vid fyra timmar föreslog återkopplingshämning. Att utesluta fyra timmars tidpunkt orsakade en liten men signifikant ökning av utgivningshastigheterna.Hastigheten för FFA-frisättning var linjär även mellan de vanliga tidpunkterna. Vid avlägsnande av media från ex vivo-lipolysproverna är det viktigt att säkerställa att vävnadsbitarna inte avlägsnas av pipetten av misstag. Det kan vara nödvändigt att mäta protein- eller lipidinnehållet i dessa prover för att korrekt normalisera resultaten.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primär Kultur och Plasmid elektroporation av Murine organ Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

C-FOS Protein Immunohistological Detection: ett användbart verktyg som en markör centralbanks involverade i specifika fysiologiska reaktioner<em&gt; In Vivo</em&gt; och<em&gt; Ex vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Mätning av styvheten hos<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aorta Använda atomkraftsmikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Isolering och differentiering av primära vita och bruna preadipocyter från nyfödda möss

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Immunofenotypning och cellsortering av mänskliga MK från mänskliga primära källor eller differentierad in vitro från hematopoetiska stamceller

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and ...

Isolering och karakterisering av fettvävnadshärledda stamceller

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Författare Spotlight: Isolering och identifiering av mesenkymala stamceller som härrör från fettvävnad från Sprague Dawley-råttor  

Isolering och identifiering av mesenkymala stamceller härrörande från fettvävnad från Sprague Dawley-råttor

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Halvautomatisk isolering av murin vit fettvävnad

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Författare Spotlight: Halvautomatisk isolering av den stromala vaskulära fraktionen från murin vit fettvävnad med hjälp av en vävnadsdissociator  

Halvautomatisk isolering av den stromala vaskulära fraktionen från murin vit fettvävnad med användning av en vävnadsdissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...