Hög ackumulering av järn i hjärnan i BPAN orsakas av dysfunktion i autofagiproteinet. Men de underliggande molekylära mekanismerna är okända. Detta protokoll ger en bedömning av nedbrytning av lysosomalt ferritin, såsom ferritinofagi.
Denna teknik erbjuder den kvantitativa, bildbaserade analysmetoden för att mäta nedbrytning av lysosomalt ferritin i enskilda celler. Bekvämt kan multiplexmetoden utökas genom att inkludera lämpliga antikroppar eller färgämnen för att mäta ytterligare cellulära parametrar. Denna metod kan identifiera och differentiera autofagiberoende och oberoende vägar för nedbrytning av lysosomalt ferritin.
Det är viktigt för att förstå dysfunktionell järnhomeostas i BPAN på cellulär nivå. Vår doktorand, Carmen Pastor-Maldonado, kommer att demonstrera metoden för att analysera nedbrytning av lysosomalt ferritin, såsom ferritinofagi. Börja självfixeringen genom att aspirera behandlingsmediet från de patienthärledda, beta-propeller-associerade neurodegenerationcellerna som sitter i en glasbottenplatta med 96 brunnar och tvätta dem två gånger med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning, eller DPBS.
Tillsätt 100 mikroliter 3,7% paraformaldehyd, eller PFA, per brunn innan du fixerar cellerna i 20 minuter vid rumstemperatur i mörkret. Efter 20 minuter avlägsnar du PFA och tvättar cellerna två gånger med PBST innan du blockerar cellerna i PBST som innehåller 1 % bovint serumalbumin, eller BSA, i en timme vid fyra grader Celsius. Tvätta sedan cellerna två gånger med PBST innan du applicerar 50 mikroliter av den primära antikroppsblandningen beredd i PBST per brunn.
Linda in plattorna med parafilm och inkubera över natten vid fyra grader Celsius. Följande morgon bereds den sekundära antikroppsblandningen i PBST i förhållandet ett till 200. Efter att ha tvättat cellerna två gånger med PBST, applicera 50 mikroliter av den nyberedda sekundära antikroppsblandningen per brunn.
Inkubera cellerna vid fyra grader Celsius i en timme i mörker. Återigen, ge två tvättar med PBST och tillsätt 100 mikroliter nyberedd fem mikrogram per mikroliter 4'6-diamidino-2-fenylindol, eller DAPI, lösning per brunn och inkubera plattan. Ge två PBS-tvättar innan du tillsätter 50 mikroliter PBS i varje brunn, inkubera sedan de inslagna plattorna vid fyra grader i mörkret.
För automatiserad avbildning av cellerna, byt ut PBS:en i plattan mot 50 mikroliter färsk PBS vid rumstemperatur. Täck plattan med aluminiumfolie för att överföra den till mikroskopirummet. Slå på det konfokala laserskanningsmikroskopet, ställ in en provhållare för 96-hålsplattor på mikroskopbordet och välj ett 40x-objektiv.
Justera bildinställningarna genom att välja lasrar och filter i Smart Setup och tilldela spåren för optimal bildkvalitet och hastighet. För att välja typ av experiment, klicka på Tiles"för att aktivera valalternativet och spara de bestämda XY-positionerna på plattan. I modulen Imaging Setup" visualiserar du exponeringskanalerna, de tilldelade spåren och deras excitations- och emissionsvåglängder.
I modulen Förvärvsläge" väljer du Skanningshastighet"som sex, Riktning"som dubbelriktad, Medelvärde"som 2x och Bitar per pixel"som åtta. I kanalmodulen finjusterar du lasereffekten, nålhålet och masterförstärkningen för varje kanal individuellt för att uppnå korrekt exponerade bilder utan att övermätta dem. Klicka sedan på modulen Fokusstrategi" och välj Kombinera programvaruautofokus och definitivt fokus.
Under Referenskanal och förskjutningar väljer du den stabilaste och ljusaste kanalen som referens. Under Upprepningar och frekvens av stabiliseringshändelser väljer du Standard. I modulen Programvarans autofokus, välj Läge"som Intensitet, Sök"som Smart, Sampling"som Fin" och Relativt intervall.
Klicka sedan på brickorna"modul. Välj befattningar som enskilda befattningar. Under Avancerade inställningar, navigera genom plattan, identifiera en position för avbildning och klicka på knappen under fliken Positionsinställning.
För att märka varje position med ytterligare information, öppna fliken Egenskaper"och klicka på hjulikonen bredvid rullgardinsmenyn för kategori, klicka sedan på Ny"för att öppna en ny dialogruta för att ange ett nytt kategorinamn. För att tilldela en kategori till en viss position, välj positionen, klicka på fliken Egenskaper, gå till rullgardinsmenyn kategorier och välj motsvarande etikett. Under Provbärare väljer du Multiwell 96 Cellvis glasbotten 0.
Klicka på Kalibrera" för att kalibrera mikroskopet till plattans yta. Välj mellan enpunkts- eller sjupunktskalibrering beroende på systemets specifikationer. Under Alternativ, välj en bricköverlappning på 10 %Under Resa i brickområden, välj Kam" och markera Använd scenhastighet från Scenkontroll, Använd scenacceleration från Scenkontroll"och Bildpyramid under förvärv.
När du är klar, kör bildinhämtning, spara bildresultaten som CZI-fil och bildmetadata som CSV-filer på en bärbar hårddisk. Exportera bilderna som TIF-filer. Skapa en separat metadata-spreadsheet-fil för bildanalys med hög genomströmning med kolumnerna position, well, condition, series och set.
Hämta lämpliga data från den ursprungliga metadatafilen som kommer från konfokal laserskanningsmikroskopi och fyll i dessa kolumner. Starta CellProfiler 4.2.4 genom att dubbelklicka och importera CellProfiler-pipelinen genom att dra och släppa. Innan du anpassar CellProfiler-pipelinen drar och släpper du enskilda CZI-bildfiler, eller en mapp som innehåller flera CZI-bildfiler, till bildmodulen.
I modulen NamesAndTypes" ersätter du koden C1-C3 med en kod som gör det möjligt för programvaran att identifiera och sortera de enkanalsbilder som ska analyseras. Om du vill optimera de numeriska posterna i modulerna finjusterar du pipelineinställningarna för modulerna IdentifyPrimaryObjects"och IdentifySecondaryObjects". För att spåra justeringarna, välj testlägesalternativet genom att klicka på knappen Starta testläge, eller alternativt Steg"-knappen mellan modulerna A.Detta kommer att resultera i ett popup-fönster som visar hur en bild skulle analyseras med dessa inställningar.
Finjustera inställningarna för optimal igenkänning. När pipelinen är optimerad, avsluta testläget och utför analysen genom att aktivera Avsluta testläge"innan du klickar på Analysera bilder"knapp. Efter analysen, verifiera cell- och punktdetekteringsnoggrannheten genom att jämföra indatabilderna med överläggsutdata som genereras av CellProfiler.
Om det inte är tillfredsställande, justera de numeriska värdena i de olika modulerna tills analysresultatet är tillräckligt exakt. Denna teknik gjorde det möjligt att använda den mjukvarubaserade celligenkänningen och ferritin- och LAMP2-igenkänningen. När den lysosomala nedbrytningen av ferritin blockerades genom tillsats av bafilomycin A1, ökade samlokaliseringen av endogent ferritin i LAMP2.
Ökningen överensstämde med dess förmåga att hämma lysosomala V-ATPas-enzymer som blockerar ferritinofagi. Immunfärgning av hög kvalitet är obligatoriskt för att analysera bilder exakt och automatiskt, det är därför lämpligt att genomföra preliminära experiment för att testa saker som antikroppsutspädningar och celldensiteter. Detta protokoll kan utökas för att utföra korrelativ ljus- och elektronmikroskopianalys.
För detta kan exakta slutsatser dras, men vilken typ av lysosomal ferritinnedbrytning som sker via ferritinofagi eller autofagioberoende vägar. Dessa strategier testas för att avgöra om de kan fånga det specifika cellulära beteendet hos BPAN-patienthärledda celler och skillnaden från celler där. Är inte muterad.
Denna metod är en del av en sådan utveckling.
