Blod-ryggmargsbarrieren er tett bundet og har begrenset permeabilitet. Denne protokollen gjør det mulig for forskere å trygt og forbigående åpne blodryggmargsbarrieren, ved hjelp av mikrobobler og fokusert ultralyd. Denne teknikken gjør at blod-ryggmargsbarriereåpningen kan lokaliseres til det målrettede ryggmargssegmentet.
I tillegg kan forstyrrelsen enkelt bekreftes via visuell observasjon eller fluorescerende mikroskopi. Denne protokollen kan utforskes for sitt potensial i å forbedre levering av genterapier, eller legemidler til ryggmargen for behandling av svulster, atrofi eller skade. Demonstrere prosedyren vil være Meghana Bhimreddy.
En fantastisk MD-student fra laboratoriet mitt, som daglig bygger bro over gapet mellom ingeniørfag og medisin. For å begynne, skaff deg et fokusert ultralydtransdusersystem med spesifikasjoner som er tilstrekkelige til å oppnå blodryggmargsbarriere, eller BSCB-åpninger hos rotter. Fest den 3D-printede sondeholderen og vannkjeglen på svingeren.
Sørg for at det er en vanntett forsegling mellom kjeglen og svingeren. Fest den steriliserte, 50 mikron tykke, akustisk gjennomsiktige polyestermembranen til bunnen av vannkeglen ved hjelp av et gummibånd. Fyll vannkjeglen med avgasset og avionisert vann ved hjelp av innløps- og utløpsrørene.
Unngå luftbobler inne i kjeglen, da de kan forstyrre akustisk kobling mellom svingeren og målet. På dette stadiet bør Mylarmembranen være litt oppblåst. Koble drivutstyret som inneholder bølgegeneratoren og radiofrekvensforsterkeren til svingeren.
Fest den stereotaktiske armen til fikseringsplaten og fest sondeholderen til armen. Registrer vekten av en bedøvet Sprague-Dawley hunnrotte, og utfør en tå- og haleklypetest for å bekrefte anestesien. Plasser en varmepute og en steril absorberende pute på fikseringsplaten.
Plasser rotta på den absorberende puten. Påfør øyesalve og plasser et rektalt termometer for å overvåke kroppstemperaturen. Palpere den siste ribben av rotta, som er festet til ryggraden ved den 13.
Bruk en elektrisk barberhøvel til å barbere pelsen av ryggflaten mellom den siste ribben og nakken. Tørk den eksponerte huden med gasbind dyppet i 10% iodopovidon. Lag et midtlinjesnitt ved hjelp av irissaks og dissekere gjennom fascia til de spinøse prosessene og lamina blir eksponert.
Fjern beinet med offset bone nippers og vinklet blad iris saks, til ryggmargen er utsatt. Fest rotta til fikseringsplaten ved å klemme de spinøse prosessene ved siden av laminektomi. Trekk deretter litt i klemmene for å gjøre ryggraden stram.
Juster transduserens posisjon med den stereotaktiske armen til den ligger nøyaktig over laminektomi. Fest laserapparatet til bunnen av vannkjeglen og senk det til laserpunktet er synlig. Juster deretter sideposisjonen til transduseren til laserpunktet er over målstedet for BSCC-forstyrrelser.
Fjern laserapparatet og fyll mellomrommet mellom kjeglen og ryggmargen med avgasset ultralydgel, uten å innføre luftbobler. Sett parametrene for sonikering på transdusereffekten. Forbered en mikrobobleløsning i henhold til produsentens instruksjoner.
For å øke sjansene for vellykket hale venekateterisering, dypp halen i varmt vann og plasser en turniquet ved foten av halen for å forstørre venene diameter. Sett deretter inn et 22 gauge hale venekateter og skyll med 0,2 ml heparinisert saltvann. Injiser en milliliter per kilo 3% Evans Blue Dye, eller EBD inn i kateteret.
Skyll deretter kateteret med 0,2 ml heparinisert saltvann. Bekreft vellykket hale venekateterisering ved å sjekke for blå fargeendring i hud, øyne eller dorsal spinal vene av rotte. Injiser 0,2 ml bolus av mikrobobler i kateteret og skyll med heparinisert saltoppløsning før du starter sonikeringen.
Etter å ha avlivet rotten, fjern ryggmargen og legg den i 4% paraformaldehyd ved fire grader Celsius over natten. Neste dag erstattes paraformaldehydet med PBS. For å visualisere BSCB-forstyrrelser, isoler en to centimeter seksjon som omgir plasseringen av sonikering, ved hjelp av et barberblad.
Del seksjonen i 10 mikron tykke seksjoner ved hjelp av en mikrotome og flekk med hematoksylindeosinflekk. For fluorescensmikroskopi, deparaffiniser lysbildet som inneholder ryggmargsseksjonen, og motflekk med 25 mikroliter DAPI oppløst i monteringsmediet. Inkuber seksjonene ved fire grader celsius i 10 minutter i mørket for å forhindre bleking.
Etter inkubering, bruk et fluorescerende mikroskop for å avbilde alle lysbildene. Bilde hematoksylin- og eosinfarget lysbilde ved hjelp av et lysmikroskop. Ryggmargsvaskulaturen er synlig etter laminektomi, og viser bakre spinalåre, med flere mindre kar som stråler lateralt.
Etter intravenøs injeksjon av EBD fremsto omkringliggende vev og ryggmargsvaskulatur som blå. Etter sonikering blir en blå flekk synlig over det målrettede stedet, noe som indikerer ekstravasasjon av EBD i den hvite parenchymen på grunn av BScb-forstyrrelse. Utskåret ryggmarg fra rotter med lav intensitet fokusert ultralyd, eller LIFU sonikering, bekreftet tilsynelatende ekstravasasjon av EBD i ryggmargen.
Mens negativt kontrollerte rotter uten LIFU-behandling ikke viste ekstravasasjon av EBD. Ryggmargen med LIFU sonikering viste betydelig større intensitet av EBD autofluorescens, enn ledninger som ikke mottok sonikering. Med lignende intensiteter av DAPI tilstede i begge.
Hematoksylin- og eosinanalyse viste ingen nevronskader, blødninger eller hulromslesjoner i sonikerte steder. Eksempler på skadede ledninger på grunn av kirurgisk mishandling, og høy drevet sonikering er vist som en sammenligning. Hos rotter som fikk mikrobobler og LIFU-behandling, ble det ikke observert noen endring i motorpoeng, presonikering, postsonikering og i løpet av en fem dagers overlevelsesperiode.
Minimale endringer i ryggmargstemperaturen ble observert før, under og etter sonikasjonsanalyse. Det er viktig å begrense kirurgisk skade på ledningen under laminektomi. Visualisering av H- og E-fargede seksjoner med mikroskopi, vil indikere om det har oppstått skade.
Etter blod-ryggmargsbarriereforstyrrelser, ved hjelp av fokus ultralyd, kan dyr injiseres med antineoplastiske midler, eller genterapier. Utfallet vil avgjøre om denne teknikken kan forbedre levering av terapeutika, og forlenge overlevelsen i innstillingen av ryggmargspatologi.