सामान्य मानव और मुराइन रक्त और अस्थि मज्जा में उपकला कोशिकाओं को व्यक्त करने वाले ईपीकैम और साइटोकेराटिन के साक्ष्य

यह तकनीक आगे के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उपयोग करने के लिए स्वस्थ व्यक्तियों के रक्त और अस्थि मज्जा में पाए जाने वाले उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदर्शित करती है। यह तकनीक फ्लो साइटोमेट्री की पहुंच के कारण स्वचालित परिसंचारी ट्यूमर सेल अलगाव की लागत के एक अंश पर उपकला कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देती है। इस पद्धति के विकास और स्टेम सेल जीव विज्ञान और पुनर्योजी चिकित्सा में निहितार्थ हो सकते हैं।

इसका उपयोग उपकला ऊतकों में घाव भरने और ऊतक रखरखाव का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। हड्डियां बहुत छोटी और नाजुक होती हैं, इसलिए हड्डियों को टूटने या खोने से बचाने के लिए देखभाल के साथ संभालें। अस्थि मज्जा अपेक्षाकृत स्थिर है, इसलिए आप उचित फसल सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे और सावधानी से काम कर सकते हैं।

शुरू करने के लिए, माउस को 500 मिलीलीटर कंटेनर में रखें और माउस के आधे हिस्से को कवर करने के लिए पर्याप्त आयोडीन जोड़ें। पूरी तरह से कवरेज सुनिश्चित करने के लिए कंटेनर को धीरे से हिलाएं और घुमाएं। फिर विआयनीकृत पानी से धो लें।

एक और आयोडीन धोएं और फिर 70% इथेनॉल के साथ दो धोएं। माउस को एक हुड में रखें और ट्रे पर उसकी पीठ पर रखें। पिछले पैरों को पकड़ें और उन्हें तब तक खींचें जब तक कि पॉप महसूस न हो।

कमर क्षेत्र के पास माउस की त्वचा पर एक सेंटीमीटर का चीरा लगाएं। चीरे में कैंची की एक बंद जोड़ी डालें और इसे पेरिटोनियम से अलग करने के लिए त्वचा के नीचे कैंची खोलें। जांघ के चारों ओर पैर पर त्वचा को काटें, फिर मांसपेशियों और हड्डियों को उजागर करने के लिए पैर के नीचे की त्वचा को काट दें।

पिछले पैर को काटने से पहले, कैंची को सही ढंग से निर्देशित करने और फीमर में कटौती को रोकने के लिए कूल्हे की हड्डी को थपथपाएं जहां अधिकांश अस्थि मज्जा स्थित है। फिर फीमर को काटे बिना कूल्हे के जोड़ के चारों ओर काटकर पिछले पैरों को हटा दें। अंगों को एक ट्यूब लेबल वाले अंगों में रखें।

इसके बाद, कैंची का उपयोग करके हड्डी के समानांतर काटकर अंगों में से एक के साथ मांसपेशियों, ऊतक और वसा को हटा दें। फिर हड्डी के लंबवत स्क्रैपिंग गति करके किसी भी शेष वसा या मांसपेशियों को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें। हड्डी को ठीक से साफ करने के बाद घुटने पर फीमर और टिबिया को अलग कर लें।

फिर फीमर और टिबिया के दोनों सिरों पर कट बनाने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें जहां कोई अस्थि मज्जा दिखाई नहीं देता है। पहले से तैयार सिरिंज और सुई को हड्डी में डालें। यदि प्रतिरोध है, तो हड्डी के अंत को ट्रिम करें जब तक कि कोई और प्रतिरोध का सामना न करना पड़े।

अस्थि मज्जा लेबल वाली ट्यूब के ऊपर हड्डी को मजबूती से पकड़ें और अस्थि मज्जा संचयन समाधान को हड्डी में इंजेक्ट करें। फिर अस्थि मज्जा को ट्यूब में फेंक दें। अस्थि मज्जा के बाकी हिस्सों को इकट्ठा करने के लिए हड्डी के दूसरे छोर के लिए दोहराएं जब तक कि हड्डी पूरी तरह से सफेद या खाली न दिखाई दे।

एक खाली 10 मिलीलीटर सिरिंज और 20 जी सुई का उपयोग करके, सिरिंज में अस्थि मज्जा को पांच से 10 बार ऊपर और नीचे खींचकर ट्यूब में अस्थि मज्जा के झुरमुट को तोड़ें। एक साफ 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 40 माइक्रोन फिल्टर जोड़ें और इसे एक मिलीलीटर अस्थि मज्जा फसल समाधान के साथ कुल्ला करें। किसी भी शेष झुरमुट को हटाने के लिए फ़िल्टर के माध्यम से अस्थि मज्जा को फ़िल्टर करें।

फिर ट्यूब फ़िल्टर किए गए अस्थि मज्जा को लेबल करें। फ़िल्टर किए गए अस्थि मज्जा को रेफ्रिजरेटर में या बर्फ पर उसी दिन उपयोग तक स्टोर करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 170 ग्राम पर अस्थि मज्जा कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।

सतह पर तैरने वाले को वैक्यूम और त्याग दें। एक x लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और चार मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर लाइसिस बफर की प्रतिक्रिया को रोकने के लिए डलबेकको के फॉस्फेट बफर्ड खारा के 30 मिलीलीटर जोड़ें।

कमरे के तापमान पर 170 ग्राम पर आठ मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और 10 से 20 मिलीलीटर धुंधला बफर में फिर से निलंबित करें। सबसे पहले, कोशिकाओं को मुआवजे के नियंत्रण सहित उपयोग किए गए धुंधला पैनल के आधार पर व्यक्तिगत रूप से लेबल किए गए ट्यूबों में विभाजित करें।

गैर-विशिष्ट धुंधलापन को अवरुद्ध करने के लिए बिना दाग वाले नियंत्रण और आइसोटोप नियंत्रण तैयार करें। प्रत्येक फ्लोरा चार के लिए, एकल दाग नियंत्रण जोड़ें और शेष फ्लोरा चार के साथ संयोजन में फ्लोरेसेंस माइनस एक नियंत्रण भी जोड़ें। इसके बाद, अनुशंसित कमजोर पड़ने के अनुसार एंटीबॉडी जोड़ें और ट्यूबों के तल को फ्लिक करके अच्छी तरह मिलाएं।

अधिमानतः कोशिकाओं की कम आबादी की कल्पना करने के लिए फाइकोएरिथ्रिन के लिए संयुग्मित ईपीकैम का उपयोग करें। अंधेरे में चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, ट्यूबों को बीएसएल टू हुड में लाएं और प्रत्येक ट्यूब में एक मिलीलीटर धुंधला बफर जोड़ें।

फिर ट्यूबों को पांच से 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 170 जी पर सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, कैप्ड ट्यूबों को बीएसएल टू हुड में लाएं और सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें। एक मिलीलीटर धुंधला बफर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और मिश्रण करने के लिए ट्यूबों के निचले हिस्से को फ्लिक करें।

धोने और सेंट्रीफ्यूजेशन को दो बार दोहराएं। अंत में, फ्लो साइटोमेट्री से पहले 500 माइक्रोलीटर धुंधला बफर में तालु को फिर से निलंबित करें। निर्माता की सिफारिशों के अनुसार DAPI या मृत सेल भेदभाव जोड़ें।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके चूहों के अस्थि मज्जा में उपकला कोशिकाओं की दुर्लभ आबादी की कल्पना की गई थी। मुराइन अस्थि मज्जा में चार से 5% कोशिकाएं ईपीकैम पॉजिटिव थीं, भले ही गिनती की गई कोशिकाओं की संख्या कुछ भी हो। मानव अस्थि मज्जा के नमूनों में दो से 5% कोशिकाएं ईपीकैम पॉजिटिव थीं।

इसके अलावा, प्रत्येक व्यक्तिगत दाता के भीतर कोशिकाओं का प्रतिशत सुसंगत था क्योंकि वृद्धिशील रूप से अधिक कोशिकाओं की गणना की गई थी। मुराइन रक्त के नमूनों में, 0.5% से कम कोशिकाएं ईपीकैम पॉजिटिव थीं। जबकि मानव रक्त के नमूनों में यह संख्या कोशिकाओं का लगभग 0.3% थी।

नियंत्रण नमूनों ने बहुत कम झूठी सकारात्मक ईपीकैम सकारात्मक कोशिकाओं को दिखाया। इसके अलावा, ईपीकैम पॉजिटिव समूह में छांटे गए कोशिकाओं ने पैन साइटोकेराटिन के लिए धुंधलापन दिखाया। जबकि ईपीकैम नकारात्मक समूह के लोगों ने साइटोकेराटिन संकेत का प्रदर्शन नहीं किया।

एक स्वच्छ और बाँझ वातावरण बनाए रखना सबसे महत्वपूर्ण है। यह नमूने में किसी भी संदूषण को रोक देगा। कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग हैं जिनका उपयोग पृथक उपकला कोशिकाओं पर उनके कार्य को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

इनमें आरएनए अनुक्रमण, विवो प्रयोगों में सेल कल्चर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी शामिल हैं।