이 기술은 건강한 개인의 혈액 및 골수에서 발견되는 상피 세포를 분리하여 추가 다운스트림 분석에 사용하는 재현 가능한 방법을 보여줍니다. 이 기술은 유세포 분석의 접근성으로 인해 자동 순환 종양 세포 분리 비용의 일부만으로 상피 세포를 분리할 수 있습니다. 이 방법은 발달 및 줄기 세포 생물학 및 재생 요법에 영향을 미칠 수 있습니다.
또한 상피 조직의 상처 치유 및 조직 유지를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 뼈는 매우 작고 깨지기 쉬우므로 뼈가 부러지거나 손실되지 않도록 주의해서 다루십시오. 골수는 비교적 안정적이므로 적절한 수확을 위해 천천히 그리고 신중하게 작업 할 수 있습니다.
시작하려면 마우스를 500밀리리터 용기에 넣고 마우스의 절반을 덮을 만큼 충분한 요오드를 추가합니다. 용기를 부드럽게 흔들고 휘젓고 완전히 덮을 수 있도록 합니다. 그런 다음 탈 이온수로 헹굽니다.
요오드 세척을 한 번 더 한 다음 70 % 에탄올로 두 번 세척하십시오. 마우스를 후드에 넣고 트레이에 등을 대고 놓습니다. 뒷다리를 잡고 팝이 느껴질 때까지 잡아 당깁니다.
사타구니 부위 근처의 마우스 피부에 1 센티미터 절개를하십시오. 닫힌 가위를 절개 부위에 삽입하고 피부 아래의 가위를 열어 복막에서 분리합니다. 허벅지 주위의 다리 피부를 자른 다음 다리 아래로 피부를 잘라 근육과 뼈를 노출시킵니다.
뒷다리를 자르기 전에 엉덩이 뼈를 촉지하여 가위를 정확하게 안내하고 대부분의 골수가있는 대퇴골에 상처를 입히지 마십시오. 그런 다음 대퇴골을 절단하지 않고 고관절 주위를 절단하여 뒷다리를 제거합니다. 팔다리라고 표시된 튜브에 팔다리를 놓습니다.
다음으로 가위를 사용하여 뼈와 평행하게 절단하여 팔다리 중 하나를 따라 근육, 조직 및 지방을 제거합니다. 그런 다음 메스를 사용하여 뼈에 수직으로 긁는 동작을 수행하여 남아 있는 지방이나 근육을 조심스럽게 제거합니다. 뼈를 제대로 청소 한 후 무릎에서 대퇴골과 경골을 분리하십시오.
그런 다음 메스를 사용하여 대퇴골과 골수가 보이지 않는 경골의 양쪽 끝을 자릅니다. 미리 준비된 주사기와 바늘을 뼈에 삽입하십시오. 저항이 있는 경우 더 이상 저항이 발생하지 않을 때까지 뼈 끝을 다듬습니다.
골수라고 표시된 튜브 위에 뼈를 단단히 잡고 골수 채취 용액을 뼈에 주입합니다. 그런 다음 골수를 튜브에 넣어 내십시오. 뼈가 완전히 하얗거나 비어 있을 때까지 뼈의 나머지 골수를 모으기 위해 뼈의 다른 쪽 끝에 대해 반복합니다.
빈 10밀리리터 주사기와 20G 바늘을 사용하여 주사기 안에서 골수를 위아래로 5-10회 당겨 튜브의 골수 덩어리를 부수십시오. 깨끗한 50밀리리터 원심분리기 튜브에 40미크론 필터를 넣고 1밀리리터의 골수 수확 용액으로 헹굽니다. 필터를 통해 골수를 걸러내어 남아 있는 덩어리를 제거합니다.
그런 다음 튜브에 여과 된 골수에 라벨을 붙입니다. 여과된 골수는 당일 사용할 때까지 냉장고나 얼음 위에 보관하십시오. 골수세포를 170G에서 실온에서 10분간 원심분리한다.
상층액을 진공 청소기로 청소하고 버립니다. 세포를 10 밀리리터의 1 x 적혈구 용해 완충액에 재현탁하고 4분 동안 배양한다. 그런 다음 30 밀리리터의 Dulbecco의 인산염 완충 식염수를 첨가하여 용해 완충액의 반응을 중지시킵니다.
실온에서 170G에서 8분 동안 세포를 원심분리합니다. 상청액을 버리고 10 내지 20 밀리리터의 염색 완충액에 재현탁시킨다. 먼저, 보정 대조군을 포함하여 사용된 염색 패널에 따라 세포를 개별적으로 라벨링된 튜브로 나눕니다.
염색되지 않은 대조군과 동위원소 대조군을 준비하여 비특이적 염색을 차단합니다. 모든 형광 4에 대해 단일 염색 대조군을 추가하고 나머지 형광 4개와 함께 형광 마이너스 1 대조군을 추가합니다. 다음으로, 권장 희석에 따라 항체를 추가하고 튜브의 바닥을 가볍게 쳐서 잘 섞는다.
가급적이면 Phycoerythrin에 결합된 EpCAM을 사용하여 낮은 세포 집단을 시각화하는 것이 좋습니다. 어둠 속에서 섭씨 4도에서 30 분 동안 배양하십시오. 배양 후 튜브를 BSL 두 개의 후드로 가져오고 각 튜브에 1밀리리터의 염색 완충액을 추가합니다.
그런 다음 튜브를 섭씨 4도에서 170G에서 5-10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 캡이 있는 튜브를 BSL 2 후드로 가져와 상층액을 흡인합니다. 1밀리리터의 염색 완충액에 세포 펠릿을 다시 현탁하고 튜브 바닥을 튕겨 혼합합니다.
세척과 원심 분리를 두 번 더 반복하십시오. 마지막으로, 유세포 분석 전에 500 마이크로리터의 염색 완충액에 구개를 다시 현탁시킵니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 DAPI 또는 죽은 세포 판별자를 추가합니다.
이 프로토콜을 사용하여 희귀 한 상피 세포 집단을 마우스의 골수에서 시각화했습니다. 쥐 골수에서 4 내지 5%의 세포는 계수된 세포의 수에 관계없이 EpCAM 양성이었다. 인간 골수 샘플에서 세포의 2 내지 5%가 EpCAM 양성이었다.
또한, 각 개별 기증자 내의 세포 비율은 점진적으로 더 많은 세포가 계산됨에 따라 일관되었습니다. 쥐 혈액 샘플에서, 세포의 0.5% 미만이 EpCAM 양성이었다. 인간 혈액 샘플에서이 수치는 약 0.3 %의 세포.
대조군 샘플은 위양성 EpCAM 양성 세포를 거의 나타내지 않았습니다. 또한, EpCAM 양성 그룹에서 분류된 세포는 범 사이토케라틴에 대한 염색을 나타내었다. EpCAM 음성 그룹의 사람들은 사이토케라틴 신호를 나타내지 않았습니다.
깨끗하고 멸균 된 환경을 유지하는 것이 가장 중요합니다. 이렇게 하면 샘플이 오염되는 것을 방지할 수 있습니다. 그 기능을 결정하기 위해 분리된 상피 세포에 사용할 수 있는 몇 가지 다운스트림 응용 프로그램이 있습니다.
여기에는 RNA 시퀀싱, 세포 배양 생체 내 실험 및 면역형광 현미경이 포함됩니다.
