819 Views
•
08:02 min
•
April 21st, 2023
DOI :
April 21st, 2023
•0:04
Introduction
0:58
Harvesting Bone Marrow from Mice
3:54
Red Blood Cell Lysis of Bone Marrow
4:38
Flow Cytometry
6:18
Results: Flow Cytometric Analysis of EpCAM+ Cells in Murine and Human Bone Marrow and Blood
7:26
Conclusion
Transcript
Denne teknikken demonstrerer en reproduserbar metode for å isolere epitelceller som finnes i blod og benmarg hos friske individer til bruk for videre nedstrøms analyse. Denne teknikken tillater isolering av epitelceller til en brøkdel av kostnaden for automatisk sirkulerende tumorcelleisolering på grunn av tilgjengeligheten av flowcytometri. Denne metoden kan ha implikasjoner i utviklings- og stamcellebiologi og regenerative terapier.
Det kan også brukes til å studere sårheling og vevsvedlikehold i epitelvev. Benene er svært små og skjøre, så håndter med forsiktighet for å forhindre snapping eller miste beinene. Benmargen er relativt stabil, slik at du kan jobbe sakte og forsiktig for å sikre riktig høsting.
For å begynne, plasser musen i en 500 ml beholder og tilsett nok jod til å dekke halvparten av musen. Rist forsiktig og virvle beholderen for å sikre grundig dekning. Skyll deretter med avionisert vann.
Utfør en jodvask til og deretter to vasker med 70% etanol. Plasser musen i en hette og legg den på ryggen på brettet. Ta tak i bakbenene og trekk dem fra hverandre til en pop er følt.
Lag et centimeter snitt på musens hud nær lyskeområdet. Sett inn en lukket saks i snittet og åpne saksen under huden for å skille den fra bukhinnen. Klipp huden på benet rundt låret, og kutt deretter huden ned i beinet for å avsløre muskler og bein.
Før du kutter bakbenet, palperer hoftebenet for å lede saksen nøyaktig og forhindre kutt i lårbenet der det meste av beinmargen er plassert. Fjern deretter bakbenene ved å kutte rundt hofteleddet uten å kutte gjennom lårbenet. Plasser lemmer i et rør merket lemmer.
Deretter fjerner du muskler, vev og fett langs en av lemmer ved å kutte parallelt med beinet ved hjelp av saks. Bruk deretter en skalpell for å forsiktig fjerne gjenværende fett eller muskler ved å utføre en skrapebevegelse vinkelrett på beinet. Etter å ha rengjort beinet ordentlig, skille lårbenet og tibia ved kneet.
Bruk deretter en skalpell til å lage kutt i begge ender av lårbenet og tibia der det ikke er synlig benmarg. Sett den ferdig forberedte sprøyten og kanylen inn i beinet. Hvis det er motstand, trim enden av beinet til det ikke oppstår mer motstand.
Hold benet fast over røret merket benmarg og injisere benmargen høsting løsning inn i beinet. Rødme deretter benmargen ut i røret. Gjenta for den andre enden av beinet for å samle resten av benmargen til benet virker helt hvitt eller tomt.
Bruk en tom 10 milliliter sprøyte og en 20G nål, bryte klumper av benmarg i røret ved å trekke benmargen opp og ned i sprøyten fem til 10 ganger. Legg til et 40 mikron filter til et rent 50 milliliter sentrifugerør og skyll det med en milliliter benmargshøstløsning. Filtrer benmargen gjennom filteret for å fjerne eventuelle gjenværende klumper.
Merk deretter røret filtrert benmarg. Oppbevar den filtrerte benmargen i kjøleskap eller på is til bruk samme dag. Sentrifuger benmargcellene ved 170G i 10 minutter ved romtemperatur.
Støvsug og kast supernatanten. Re-suspendere cellene i 10 ml av en x røde blodlegemer lysebuffer og inkubere i fire minutter. Deretter tilsettes 30 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvann for å stoppe reaksjonen av lysisbufferen.
Sentrifuger cellene i åtte minutter ved 170G ved romtemperatur. Kast supernatanten og heng opp igjen i 10 til 20 milliliter fargebuffer. Først deler du cellene i individuelt merkede rør basert på fargepanelet som brukes, inkludert kompensasjonskontroller.
Forbered ufargede kontroller og isotopkontroller for å blokkere ikke-spesifikk farging. For hver fluor fire, legg til enkelt flekkkontroll og legg også til fluorescens minus en kontroller i kombinasjon med gjenværende fluora firere. Deretter tilsettes antistoffer i henhold til anbefalt fortynning og blandes godt ved å flikke bunnen av rørene.
Bruk helst EpCAM konjugert til Phycoerythrin for å visualisere lave populasjoner av celler. Inkuber i 30 minutter ved fire grader Celsius i mørket. Etter inkubering, ta rørene til BSL to hette og tilsett en milliliter fargebuffer til hvert rør.
Sentrifuger deretter rørene ved 170G ved fire grader Celsius i fem til 10 minutter. Etter sentrifugering, ta de kappede rørene til BSL to hetten og aspirer supernatanten. Suspender cellepelleten på nytt i en milliliter fargebuffer og knips bunnen av rørene for å blande.
Gjenta vask og sentrifugering to ganger til. Til slutt suspenderer du ganen på nytt i 500 mikroliter fargebuffer før flowcytometri. Legg til DAPI eller død celle diskriminator i henhold til produsentens anbefalinger.
Ved hjelp av denne protokollen ble sjeldne populasjoner av epitelceller visualisert i benmargen til mus. Fire til 5 % av cellene i benmargen var EpCAM-positive, uavhengig av antall celler som ble telt. I humane benmargsprøver var to til 5 % av cellene EpCAM-positive.
Prosentandelen av celler i hver enkelt donor var også konsistent ettersom flere celler ble talt trinnvis. I blodprøver fra mus var mindre enn 0,5 % av cellene EpCAM-positive. Mens i humane blodprøver var dette tallet rundt 0,3% av cellene.
Kontrollprøvene viste svært få falskt positive EpCAM-positive celler. Videre viste cellene sortert i den EpCAM-positive gruppen farging for pan cytokeratin. Mens de fra den EpCAM-negative gruppen ikke viste cytokeratinsignalet.
Det er viktigst å opprettholde et rent og sterilt miljø. Dette vil forhindre forurensning til prøven. Det finnes flere nedstrøms applikasjoner som kan brukes på de isolerte epitelceller for å bestemme deres funksjon.
Disse inkluderer RNA-sekvensering, cellekultur in vivo-eksperimenter og immunfluorescensmikroskopi.
Denne artikkelen presenterer en reproduserbar metode med nye funn om tilstedeværelse av epitelceller i normalt humant og musblod og benmarg ved bruk av flowcytometri og immunfluorescensmikroskopi. Krt1-14;mTmG transgene mus ble brukt som en in vivo metode for å bekrefte disse funnene.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved