Structurele studies van microtubuli-interagerende eiwitten door cryo-elektronenmicroscopie zijn cruciaal om cellulaire mechanismen te begrijpen. Het bereiden van homogene microtubuli gebonden aan interagerende eiwitten op een cryo-EM-raster is cruciaal voor succes. Dit protocol is eenvoudig, goedkoop en het maakt het mogelijk om microtubuli te bereiden met gecontroleerde posttranslationele modificaties in voldoende kwantiteit en kwaliteit voor cryo-elektronenmicroscopie.
Microtubuli zijn zeer temperatuurgevoelig. Het is daarom belangrijk om de microtubuli-bevattende oplossingen warm te houden om depolymerisatie te voorkomen. Om te beginnen kweek je genetisch gemodificeerde HCT116-cellijn in DMEM-celkweekmedium totdat zes tot 12 confluente platen zijn verkregen.
Was de cellen voorzichtig met 10 milliliter PBS om elk celkweekmedium te verwijderen. Maak de cellen los van de platen door de cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur te incuberen met drie milliliter ijskoude PBS aangevuld met vijf-millimolaire EDTA en vervolgens met behulp van een celschraper. Verzamel de cellen in een buis van 50 milliliter op ijs en draai gedurende 10 minuten op 250 G.
Let op het volume van de geoogste cellen met de volumetrische schaal op de buis. Resuspendie de geoogste celpellet in een gelijk volume lysisbuffer en lysecellen door ultrasoonapparaat. Voeg na sonicatie, voor SDS-PAGE-analyse, twee microliter lysaat toe in een buis met 18 microliter water en vijf microliter 5X SDS-monsterbuffer.
Pipetteer de resterende gelyseerde cellen in een centrifugebuis en draai gedurende één uur bij 100.000 G bij vier graden Celsius in een ultracentrifugerotor om het lysaat te verwijderen. Verwijder met een spuit het geklaarde lysaat zonder de pellet en de drijvende laag bovenop te verstoren. Voeg twee microliter geklaard lysaat toe aan een buis met 18 microliter water en vijf microliter 5X SDS-monsterbuffer.
Spoel de pellet voorzichtig af en schep een klein beetje van de pellet op door een P-10 pipetpunt door de pellet te draaien. Voeg vervolgens 200 microliter water en 50 microliter SDS-buffer toe. Voeg één millimolaire GTP en 20 micromolaire paclitaxel toe aan een verzameld supernatant om de microtubuli te polymeriseren en gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius te incuberen om de microtubuli te laten assembleren.
Bereid de kussenbuffer voor door 600 microliter glycerol toe te voegen aan 400 microliter lysisbuffer en vul het mengsel aan met 20 micromolar paclitaxel. Verwarm de buffer voor op 37 graden Celsius. Voeg 800 microliter kussenbuffer toe aan een ultracentrifugebuis.
Pipetteer vervolgens het met GTP-paclitaxel aangevulde lysaat voorzichtig bovenop de kussenbuffer. Plaats de buis in een ultracentrifugerotor om gedurende 30 minuten op 100.000 G bij 30 graden Celsius te draaien. Markeer de naar buiten gerichte rand van de buis om gemakkelijk te herkennen waar de microtubule-pellet zich moet vormen.
Verwijder na het centrifugeren de kussenbuffer voorzichtig met behulp van een pipet zonder de pellet te verstoren. Voeg voorzichtig lysisbuffer toe naast de pellet, draai de buis een paar keer om zoveel mogelijk glycerol uit de pellet en de wanden van de buis te verwijderen en zuig vervolgens de wasstap drie keer op en herhaal deze. Resuspendie de gewassen pellet voorzichtig met een gesneden punt in 50 microliter voorverwarmde resuspensiebuffer en plaats de buis op 37 graden Celsius.
Voeg twee microliter geresuspendeerde pelletfractie toe in 18 microliter water en vijf microliter 5X SDS-monsterbuffer. Bereid het dompelvriezerapparaat voor door het vloeipapier te installeren. Stel de temperatuur van het apparaat in op 30 graden Celsius en de bevochtiging op 100%Laat het apparaat gedurende 30 minuten in evenwicht zijn.
Bereid de instellingen van de dompelvriezer voor op twee toepassingen. Stel voor de eerste toepassing de kracht in op 10, twee seconden vlektijd en nul seconden wachttijd. Stel voor de tweede toepassing de kracht in op 10, 6,5 seconden vlektijd en 10 seconden wachttijd.
Plaats de roosters met hun carbon kant omhoog in het metalen gloeiontladingsvoertuig. Glow ontlaadt de cryo-elektronenmicroscopie, of EM-roosters, op 30 milliamperes gedurende 60 seconden. Koel de polystyreencontainer met vloeibare stikstof en bereid vloeibaar ethaan in een metalen beker door ethaangas in een koude metalen beker te condenseren.
Verdun het microtubuli-interagerende eiwit in gelijk volume met verdunningsbuffer voordat u het op de roosters aanbrengt om de celconcentratie te verlagen. Zet de mixer op 37 graden Celsius. Gebruik een warm metalen blok in een isolerende polystyreendoos als er geen verwarmingsblok in de buurt van een dompelvriesapparaat is.
Pak een gloeiend rooster met een pincet en klik ze in de diepvries. Plaats de polystyreencontainer met vloeibaar ethaan in de dompelvriezer en doorloop het voorbereide programma. Breng eerst 3,5 microliter microtubuli-oplossing aan op het rooster.
Laat de diepvries het rooster deppen. Breng vervolgens onmiddellijk 3,5 microliter verdund eiwit aan. En ten slotte, laat de zuiger deppen en dompel het rooster in vloeibaar ethaan bevriezen.
Breng de roosters over in een rasteropslagdoos en bewaar ze in een vloeibare stikstof Dewar tot beeldvorming. De kwaliteit en concentratie van de geëxtraheerde microtubuli werden beoordeeld met Coomassie-gekleurde SDS-gel. Een niet-lineaire regressielijn van de relatieve BSA-grootheden, afgeleid van de interpolatie van de microtubuliband rond 50 kilodalton in de P2-baan met de BSA-curve, geeft een eindconcentratie van 1,42 milligram per milliliter aan.
Dit komt goed overeen met het aantal gemeten met een spectrofotometer door twee personen. De vers geëxtraheerde microtubuli werden gebruikt om cryo-EM-monsters te maken. De microtubuli zien er intact en overvloedig uit op de microfoto's.
De microtubulidichtheid per microfoto mag niet te hoog zijn om te voorkomen dat de microtubuli elkaar kruisen. Gebroken microtubuli geven aan dat de microtubuli zijn gedepolymeriseerd, of dat de concentratie van microtubuli te dicht was. Microtubuli gebonden aan MATCAP hadden ruwe randen die werden gekenmerkt door elektrondichte stippen op het microtubulioppervlak.
MATCAP-gebonden en MATCAP-ongebonden microtubuli konden ook worden onderscheiden in de berekende 2D-klassen. Het maken van cryo-EM-roosters met deze methode kan het mogelijk maken om de structuur van microtubuli gebonden aan een specifiek interagerend eiwit te bestuderen. Dit kan leiden tot een beter begrip van de mechanismen in de structurele celbiologie.