Strukturella studier av mikrotubuli-interagerande proteiner med kryoelektronmikroskopi är avgörande för att förstå cellulära mekanismer. Att förbereda homogena mikrotubuli bundna till interagerande proteiner på ett kryo-EM-rutnät är avgörande för framgång. Detta protokoll är enkelt, billigt och det gör det möjligt att förbereda mikrotubuli med kontrollerade posttranslationella modifieringar i tillräcklig mängd och kvalitet för kryoelektronmikroskopi.
Mikrotubuli är mycket temperaturkänsliga. Det är därför viktigt att hålla de mikrotubuliinnehållande lösningarna varma för att förhindra depolymerisation. För att börja odla genetiskt modifierad HCT116-cellinje i DMEM-cellodlingsmedium tills sex till 12 konfluenta plattor erhålls.
Tvätta cellerna försiktigt med 10 ml PBS för att avlägsna eventuellt cellodlingsmedium. Lossa cellerna från plattorna genom att inkubera cellerna i fem minuter vid rumstemperatur med tre milliliter iskall PBS kompletterat med fem millimolar EDTA och därefter använda en cellskrapa. Samla cellerna i ett 50 ml rör på is och snurra vid 250 G i 10 minuter.
Notera volymen av de skördade cellerna med den volymetriska skalan på röret. Resuspendera den skördade cellpelleten i en lika stor volym lysbuffert och lyseceller genom ultraljudsbehandling. Efter ultraljudsbehandling, för SDS-PAGE-analys, tillsätt två mikroliter lysat i ett rör innehållande 18 mikroliter vatten och fem mikroliter 5X SDS-provbuffert.
Pipettera de återstående lyserade cellerna till ett centrifugrör och snurra vid 100 000 G i en timme vid fyra grader Celsius i en ultracentrifugrotor för att rensa lysatet. Ta bort det rensade lysatet med en spruta utan att störa pelleten och det flytande skiktet ovanpå. Tillsätt två mikroliter rensat lysat i ett rör innehållande 18 mikroliter vatten och fem mikroliter 5X SDS-provbuffert.
Skölj försiktigt pelleten och skopa upp lite av pelleten genom att virvla en P-10-pipettspets genom pelleten. Tillsätt sedan 200 mikroliter vatten och 50 mikroliter SDS-buffert. Tillsätt en millimolär GTP och 20 mikromolar paklitaxel i en uppsamlad supernatant för att polymerisera mikrotubuli och inkubera vid 37 grader Celsius i 30 minuter så att mikrotubuli kan monteras.
Förbered kuddbufferten genom att tillsätta 600 mikroliter glycerol till 400 mikroliter lysbuffert och komplettera blandningen med 20 mikromolar paklitaxel. Förvärm bufferten till 37 grader Celsius. Tillsätt 800 mikroliter kuddbuffert till ett ultracentrifugrör.
Pipettera sedan det GTP-paklitaxel-kompletterade lysatet försiktigt ovanpå kuddbufferten. Placera röret i en ultracentrifugrotor för att snurra vid 100 000 G vid 30 grader Celsius i 30 minuter. Markera rörets utåtvända kant för att lätt känna igen var mikrotubulipelletsen ska bildas.
Efter centrifugering, ta försiktigt bort kuddebufferten med en pipett utan att störa pelleten. Tillsätt försiktigt lysbuffert bredvid pelleten, rotera röret några gånger för att ta bort så mycket glycerol som möjligt från pelleten och rörets väggar och aspirera sedan och upprepa tvättsteget tre gånger. Återsuspendera den tvättade pelleten försiktigt med en skuren spets i 50 mikroliter förvärmd resuspensionsbuffert och placera röret vid 37 grader Celsius.
Tillsätt två mikroliter återsuspenderad pelletsfraktion i 18 mikroliter vatten och fem mikroliter 5X SDS-provbuffert. Förbered dykfrysanordningen genom att installera blottpapperet. Ställ in enhetens temperatur på 30 grader Celsius och befuktning på 100 %Låt enheten balansera i 30 minuter.
Förbered inställningarna för dykfrysen för två applikationer. För den första applikationen ställer du in kraften på 10, två sekunders blottningstid och noll sekunders väntetid. För den andra applikationen ställer du in kraften på 10, 6,5 sekunders fläcktid och 10 sekunders väntetid.
Placera gallren med kolfibersidan uppåt i metallglödurladdningsfordonet. Glödurladdning kryoelektronmikroskopi, eller EM-galler, vid 30 milliampere i 60 sekunder. Kyl polystyrenbehållaren med flytande kväve och förbered flytande etan i en metallkopp genom att kondensera etangas till en kall metallkopp.
Späd det mikrotubuli-interagerande proteinet i lika stor volym med utspädningsbuffert innan du applicerar det på gallret för att sänka cellkoncentrationen. Placera mixern vid 37 grader Celsius. Använd ett varmt metallblock i en isolerande polystyrenlåda om det inte finns något värmeblock nära doppfrysningsanordningen.
Ta ett glödurladdat galler med pincett och klicka in dem i frysen. Placera polystyrenbehållaren med flytande etan i dykfrysen och kör genom det förberedda programmet. Applicera först 3,5 mikroliter mikrotubulilösning på gallret.
Låt doppfrysen blotta gallret. Applicera sedan omedelbart 3,5 mikroliter utspätt protein. Och slutligen, låt kolven blotta och frysa gallret i flytande etan.
Överför gallren till en gallerförvaringslåda och förvara dem i en flytande kväve Dewar tills avbildning. Kvaliteten och koncentrationen av de extraherade mikrotubuli bedömdes med Coomassie-färgad SDS-gel. En icke-linjär regressionslinje av de relativa BSA-kvantiteterna, härledd från interpoleringen av mikrotubulibandet runt 50 kilodalton i P2-banan med BSA-kurvan, indikerar en slutlig koncentration på 1,42 milligram per milliliter.
Detta överensstämmer väl med antalet uppmätt med en spektrofotometer av två personer. De nyligen extraherade mikrotubuli användes för att göra kryo-EM-prover. Mikrotubuli ser intakta och rikliga ut på mikrograferna.
Mikrotubulidensiteten per mikrografi bör inte vara för hög för att undvika att mikrotubuli passerar över varandra. Brutna mikrotubuli indikerar att mikrotubuli är depolymeriserade, eller att koncentrationen av mikrotubuli var för tät. Mikrotubuli bundna till MATCAP hade grova kanter som kännetecknades av elektrontäta prickar på mikrotubuliytan.
MATCAP-bundna och MATCAP-obundna mikrotubuli kunde också urskiljas i de beräknade 2D-klasserna. Att göra kryo-EM-galler med denna metod kan göra det möjligt att studera strukturen hos mikrotubuli bundna till ett specifikt interagerande protein. Detta kan leda till en bättre förståelse av mekanismerna i strukturell cellbiologi.