Den præsenterede protokol er en meget fleksibel metode til genommanipulation i museovidukten. Det tillader dannelse af sporadisk muteret celle omgivet af uredigerede celler i immunkompetent miljø. Dette er fordelagtigt at studere kræftinitiering.
Den største fordel ved denne teknik er dens høje tilpasningsevne til at målrette mod et organ, område, region eller celletype af interesse med let udskiftelige sæt mutationskombinationer, alt sammen uden det absolutte behov for en muselinje. Denne metode kan let tilpasses til brug i organer med lumen såvel som organparenchyma. Til at begynde med skal du trække et glaskapillarrør ind i et skarpt punkt ved hjælp af en mikropipettetrækker.
Brug en konisk, ultra finspids tang til at klippe den spidse ende af det trukne kapillarrør under et dissekerende mikroskop for at skabe en åbning. Sørg for, at åbningen ikke er for stor, da det vil beskadige ovidukten og forhindre langsom injektion. Derefter skal du arrangere det sterile kirurgiudstyr, mikroskop, mikromanipulator og elektroporator på en ren, steril bænk eller inde i biosikkerhedsskabet.
Opvarm varmepuden på en skive og læg den under et rent, fuldt udstyret bur. Hæld steril 1X PBS i en petriskål. Brug en ren saks til at skære det absorberende papir i firkanter på en centimeter.
Drop disse i PBS for at suge dem. Fastgør derefter den trukne kapillarnål til den klemmemonterede mikromanipulator, stabiliseret af en magnetisk holder. To mikroliter injektionsopløsning pipetteres på en steril petriskål.
Mens du observerer under mikroskopet, skal du langsomt tage en til to mikroliter af injektionsopløsningen op i mikroinjektionsnålen ved hjælp af den lufttrykssprøjte, der er fastgjort til mikromanipulatoren. Undgå at optage bobler i nålen. Efter bedøvelse af en seks til otte uger gammel hunmus og administration af carprofen subkutant, skal du placere musen på det opvarmede absorberende papir med den dorsale side opad.
Påfør øjensmøremiddel på hvert øje for at forhindre udtørring under operationen. Efter at have bekræftet bedøvelsesstoppet ved at klemme tåen med et par tang, skal du fjerne dorsal pels omkring det potentielle snitsted og tørre den blotte hud med antiseptisk middel. Brug et par lige, stumpe tang til at klemme den bare hud og skabe et centimeter langt snit langs kroppens midterlinje ved hjælp af en steril saks.
Klem og hold den ene side af det afskårne sted op ved hjælp af et par sterile Adson-tang. Brug derefter et par sterile, buede, serrated tang, forsigtigt adskille huden fra kropsvæggen, begyndende ved midterlinjen snit og bevæger sig sideværts. Når du har lokaliseret fedtpuden under nyrerne, skal du bruge et par sterile, lige, stumpe tang til at klemme kropsvæggen direkte over fedtpuden.
Opret et lille snit i kropsvæggen ved hjælp af et par sterile, skarpe, spidse dissekerende saks, og pas på at undgå blodkar. Mens du stadig klemmer kropsvæggen med lige, stump tang, skal du indsætte et par sterile, stump, buede tang i snittet og udvide snittet skabt i kropsvæggen. Tag fat i den synlige fedtpude med den stump, buede, tang og træk den ud af hullet for at udsætte æggestokken, ovidukten og livmoderen.
Hold reproduktionssporet udsat ved at klemme fedtpuden med en steril bulldogklemme. Placer forsigtigt den bedøvede mus med reproduktionssporet udsat på scenen af et dissekerende mikroskop. Mikromanipulatoren justeres, således at injektionsnålen med opløsningen observeres under mikroskopet.
Derefter manipulere mikroskopet for let at observere æggestokken, ovidukten og livmoderen. Brug et par sterile, tilspidsede, ultra fine spids tang, hold regionen af ovidukten, der skal injiceres. Regionen skal flugte med mikroinjektionsnålens retning.
Juster mikromanipulatoren til at punktere ovidukten med mikroinjektionsnålen, mens du samtidig fører ovidukten på nålen ved hjælp af de koniske, ultra fine spidspincet. Flyt forsigtigt mikroinjektionsnålen for at bekræfte, at den er indsat i ovidukten. Injicer langsomt en mikroliter af injektionsopløsningen og 5% filtreret trypanblåt ind i ovidukten, mens du observerer bevægelsen af den blå opløsning og udvidelsen af oviduktlumen.
Undgå at indføre bobler i lumen. Efter injektionen fjernes nålen fra ovidukten, og målområdet dækkes med et stykke absorberende papir, der er gennemvædet med PBS. Tag fat i det gennemblødte papir og det område, der skal målrettes med en elektrodepincet, og træk væk fra kroppen.
Elektroporere målområdet ved hjælp af tre unipolære impulser ved 30 volt i 50 millisekunder med intervaller på et sekund. Efter elektroporering fjernes det absorberende papir, og musen placeres tilbage på varmepuden. Fjern bulldogklemmen, og skub forsigtigt det blottede reproduktive spor tilbage under kropsvæggen.
Når begge ovidukter er blevet elektroporeret og placeret tilbage under kropsvæggen, skal du bruge en nåleholder til at gribe nålen. Klem og hold den ene side af det skårne sted op ved hjælp af et par sterile, buede, takkede tang. Brug derefter nåleholderen til at manipulere suturen og lukke såret.
Flyt musen ind i et rent bur placeret oven på en varmepude og overvåg, indtil musen er aktiv. Ved elektroporation ved hjælp af tre- eller en millimeter pincet-type elektroder blev det målrettede område mærket med TdTomato begrænset til det distale oviduktepitel. Med tre millimeter pincet-type elektroder blev et meget større område af ampullen målrettet sammenlignet med kun at målrette mod den distale spids, infundibulum, ved hjælp af en millimeter pincet-type elektroder.
I målområdet blev elektroporerede celler markeret med TdTomato tilfældigt fordelt blandt ikke-elektroporerede celler. Derudover var elektroporerede celler begrænset til slimhindepitelet og ikke observeret i det underliggende stromale eller muskellag. For at bekræfte CRISPR-medieret genomredigering kan fluorescerende celler isoleres ved FACS-sortering til DNA-isolering og sekventering.
Dette giver os mulighed for at kvantificere hyppigheden af målrettede alleler, spore den unikke kommunikation mellem prøven for at følge in vivo koronal udvikling af primær tumor og metastase i immunkompetent miljø.
