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May 5th, 2023
DOI :
May 5th, 2023
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Introduction
1:01
Preparing Microinjection Needle, Surgery Area, Solution, and Needle for Injection
2:26
Exposing the Female Reproductive Tract
4:11
In Vivo Oviduct Injection and Electroporation
6:29
Results: Validation of Successful In Vivo Injection and Electroporation of Oviduct Epithelial Cells
7:16
Conclusion
Transcript
प्रस्तुत प्रोटोकॉल माउस ओविडक्ट में जीनोम हेरफेर के लिए एक अत्यधिक लचीली विधि है। यह इम्यूनोसक्षम वातावरण के भीतर असंपादित कोशिकाओं से घिरे छिटपुट उत्परिवर्तित सेल के गठन की अनुमति देता है। यह कैंसर दीक्षा का अध्ययन करने के लिए फायदेमंद है।
इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह उत्परिवर्तन संयोजनों के आसानी से विनिमेय सेटों के साथ एक अंग, क्षेत्र, क्षेत्र या सेल प्रकार की रुचि को लक्षित करने में उच्च अनुकूलनशीलता है, सभी माउस लाइन की पूर्ण आवश्यकता के बिना। इस विधि को लुमेन के साथ-साथ अंग पैरेन्काइमा के साथ अंगों में उपयोग के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। शुरू करने के लिए, एक माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके एक ग्लास केशिका ट्यूब को एक तेज बिंदु में खींचें।
पतली, अल्ट्रा फाइन-टिप फोर्सप्स की एक जोड़ी का उपयोग करके, एक छिद्र बनाने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत खींची गई केशिका ट्यूब के नुकीले छोर को स्निप करें। सुनिश्चित करें कि उद्घाटन बहुत बड़ा नहीं है, क्योंकि यह डिंबवाहिनी को नुकसान पहुंचाएगा और धीमी गति से इंजेक्शन को रोक देगा। इसके बाद, बाँझ सर्जरी उपकरण, माइक्रोस्कोप, माइक्रोमैनिपुलेटर और इलेक्ट्रोपोरेटर को एक साफ, बाँझ बेंच पर या जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर व्यवस्थित करें।
एक डिस्क पर हीटिंग पैड गर्म करें और इसे एक साफ, पूरी तरह से सुसज्जित पिंजरे के नीचे रखें। एक पेट्री डिश में बाँझ 1 एक्स पीबीएस डालें। साफ कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके, शोषक कागज को एक-एक सेंटीमीटर वर्ग में काट लें।
इन्हें भिगोने के लिए पीबीएस में छोड़ दें। इसके बाद, खींची गई केशिका सुई को क्लैंप-माउंट माइक्रोमैनिपुलेटर से जोड़ें, जो चुंबकीय माउंट द्वारा स्थिर होता है। एक बाँझ पेट्री डिश पर इंजेक्शन समाधान के दो माइक्रोलीटर पिपेट।
माइक्रोस्कोप के नीचे अवलोकन करते समय, धीरे-धीरे माइक्रोमैनिपुलेटर से जुड़ी वायु-दबाव वाली सिरिंज का उपयोग करके इंजेक्शन समाधान के एक से दो माइक्रोलीटर को माइक्रोइंजेक्शन सुई में लें। सुई में बुलबुले लेने से बचें। छह से आठ सप्ताह की मादा माउस को एनेस्थेटाइज करने और कारप्रोफेन को चमड़े के नीचे प्रशासित करने के बाद, माउस को गर्म शोषक पेपर पर पृष्ठीय पक्ष के साथ रखें।
सर्जरी के दौरान सूखने से बचाने के लिए प्रत्येक आंख पर नेत्र स्नेहक लागू करें। पैर की अंगुली को बल की एक जोड़ी के साथ चुटकी लेकर एनेस्थेटिक गिरफ्तारी की पुष्टि करने के बाद, संभावित चीरा स्थल के चारों ओर पृष्ठीय फर हटा दें और एंटीसेप्टिक के साथ नंगे त्वचा को पोंछ दें। नंगी त्वचा को चुटकी लेने के लिए सीधे, कुंद बल की एक जोड़ी का उपयोग करें और बाँझ कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके शरीर की मध्य रेखा के साथ एक सेंटीमीटर लंबा चीरा बनाएं।
बाँझ एडसन फोर्सप्स की एक जोड़ी का उपयोग करके कट साइट के एक तरफ चुटकी लें और पकड़ें। फिर, बाँझ, घुमावदार, घुमावदार बल की एक जोड़ी का उपयोग करके, धीरे से शरीर की दीवार से त्वचा को अलग करें, मध्य रेखा चीरा से शुरू करें और पार्श्व की ओर बढ़ें। गुर्दे के नीचे वसा पैड का पता लगाने के बाद, वसा पैड के ऊपर सीधे शरीर की दीवार को चुटकी लेने के लिए बाँझ, सीधे, कुंद बल की एक जोड़ी का उपयोग करें।
रक्त वाहिकाओं से बचने के लिए बाँझ, तेज, नुकीले विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके शरीर की दीवार में एक छोटा चीरा बनाएं। अभी भी शरीर की दीवार को सीधे, कुंद, बल के साथ चुटकी लेते हुए, बाँझ, कुंद, घुमावदार बल की एक जोड़ी चीरे में डालें और शरीर की दीवार में बने चीरे को चौड़ा करें। दिखाई देने वाले वसा पैड को कुंद, घुमावदार, बल के साथ पकड़ें और अंडाशय, डिंबवाहिनी और गर्भाशय को उजागर करने के लिए इसे छेद से बाहर खींचें।
एक बाँझ बुलडॉग क्लैंप के साथ वसा पैड को दबाकर प्रजनन ट्रैक को उजागर रखें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के चरण पर उजागर प्रजनन ट्रैक के साथ एनेस्थेटाइज्ड माउस को ध्यान से रखें। माइक्रोमैनिपुलेटर को समायोजित करें जैसे कि माइक्रोस्कोप के नीचे समाधान के साथ इंजेक्शन सुई देखी जाती है।
फिर अंडाशय, डिंबवाहिनी और गर्भाशय का आसानी से निरीक्षण करने के लिए माइक्रोस्कोप में हेरफेर करें। बाँझ, पतली, अल्ट्रा फाइन-टिप फोर्स की एक जोड़ी का उपयोग करके, ओविडक्ट के क्षेत्र को इंजेक्ट करने के लिए पकड़ें। क्षेत्र को माइक्रोइंजेक्शन सुई की दिशा के साथ संरेखित करना चाहिए।
माइक्रोइंजेक्शन सुई के साथ डिंबवाहिनी को पंचर करने के लिए माइक्रोमैनिपुलेटर को समायोजित करें, जबकि साथ ही साथ पतले, अल्ट्रा फाइन-टिप फोर्सप्स का उपयोग करके डिंबवाहिनी को सुई पर खिलाएं। माइक्रोइंजेक्शन सुई को धीरे से हिलाएं ताकि यह पुष्टि हो सके कि इसे ओविडक्ट में डाला गया है। धीरे-धीरे इंजेक्शन समाधान के एक माइक्रोलीटर और 5% फ़िल्टर किए गए ट्राइपैन ब्लू को ओविडक्ट में इंजेक्ट करें, जबकि नीले घोल की गति और ओविडक्ट लुमेन के विस्तार को देखते हुए।
लुमेन में किसी भी बुलबुले को पेश करने से बचें। इंजेक्शन के बाद, डिंबवाहिनी से सुई निकालें और पीबीएस में पहले से भिगोए गए शोषक कागज के टुकड़े के साथ लक्षित किए जाने वाले क्षेत्र को कवर करें। पहले से भिगोए हुए कागज और इलेक्ट्रोड ट्वीज़र्स की एक जोड़ी के साथ लक्षित किए जाने वाले क्षेत्र को पकड़ें और शरीर से दूर खींचें।
एक सेकंड के अंतराल के साथ 50 मिलीसेकंड के लिए 30 वोल्ट पर तीन एकध्रुवीय दालों का उपयोग करके लक्ष्य क्षेत्र को इलेक्ट्रोपोरेट करें। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, शोषक पेपर को हटा दें और माउस को हीटिंग पैड पर वापस रखें। बुलडॉग क्लैंप को खोलें और उजागर प्रजनन ट्रैक को शरीर की दीवार के नीचे वापस धकेलें।
दोनों अंडाणुओं को इलेक्ट्रोपोरेट करने और शरीर की दीवार के नीचे वापस रखने के बाद, सुई को पकड़ने के लिए सुई धारक का उपयोग करें। बाँझ, घुमावदार, घुमावदार बल की एक जोड़ी का उपयोग करके कट साइट के एक तरफ चुटकी लें और पकड़ें। फिर, सीवन में हेरफेर करने और घाव को बंद करने के लिए सुई धारक का उपयोग करें।
माउस को हीटिंग पैड के शीर्ष पर रखे एक साफ पिंजरे में ले जाएं और माउस सक्रिय होने तक निगरानी करें। तीन या एक-मिलीमीटर चिमटी-प्रकार के इलेक्ट्रोड का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेशन पर, टीडीटोमैटो के साथ लेबल किए गए लक्षित क्षेत्र को डिस्टल ओवीडक्ट एपिथेलियम तक सीमित कर दिया गया था। तीन-मिलीमीटर चिमटी-प्रकार इलेक्ट्रोड के साथ, एम्पुले के एक बहुत बड़े क्षेत्र को एक-मिलीमीटर चिमटी-प्रकार इलेक्ट्रोड का उपयोग करके केवल डिस्टल मोस्ट-टिप, इंफंडिबुलम को लक्षित करने की तुलना में लक्षित किया गया था।
लक्षित क्षेत्र में, टीडीटोमैटो द्वारा चिह्नित इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को यादृच्छिक रूप से गैर-इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं के बीच वितरित किया गया था। इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को म्यूकोसल एपिथेलियम तक सीमित किया गया था और अंतर्निहित स्ट्रोमल या मांसपेशियों की परत में नहीं देखा गया था। सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता जीनोम संपादन की पुष्टि करने के लिए, फ्लोरोसेंट सेल को डीएनए अलगाव और अनुक्रमण के लिए एफएसीएस सॉर्टिंग द्वारा अलग किया जा सकता है।
यह हमें लक्षित एलील्स की आवृत्ति को मापने की अनुमति देता है जो प्राथमिक ट्यूमर के विवो कोरोनल विकास और इम्यूनोसक्षम वातावरण में मेटास्टेसिस का पालन करने के लिए नमूने के बीच अद्वितीय संचार को ट्रैक करता है।
यह प्रोटोकॉल माउस ओविडक्ट में क्षेत्रीय रूप से प्रतिबंधित सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता जीनोम संपादन के लिए माइक्रोइंजेक्शन और विवो इलेक्ट्रोपोरेशन में वर्णन करता है।
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