提示されたプロトコルは、マウス卵管におけるゲノム操作のための非常に柔軟な方法です。これは、免疫適格環境内で未編集の細胞に囲まれた散発的に変異した細胞の形成を可能にする。これは、がんの発生を研究するのに有利です。
この技術の主な利点は、マウス系統を絶対的に必要とせずに、簡単に交換可能な変異の組み合わせのセットを使用して、目的の臓器、領域、領域、または細胞タイプを標的とする高い適応性です。この方法は、内腔および臓器実質を有する臓器での使用に容易に適合させることができる。まず、マイクロピペットプラーを使用してガラスキャピラリーチューブを鋭いポイントに引き込みます。
一対のテーパー状の超極細先端鉗子を使用して、抜剖顕微鏡の下で引っ張られた毛細管の尖った端を切り取り、開口部を作ります。開口部は卵管を損傷し、ゆっくりとした注入を防ぐため、大きすぎないようにしてください。次に、滅菌手術器具、顕微鏡、マイクロマニピュレーター、およびエレクトロポレーターを清潔で滅菌済みのベンチまたはバイオセーフティキャビネット内に配置します。
ディスク上の加熱パッドを加熱し、清潔で設備の整ったケージの下に置きます。滅菌した1X PBSをペトリ皿に注ぎます。きれいなはさみを使用して、吸収紙を1×1センチメートルの正方形に切ります。
これらをPBSに落として浸します。次に、引っ張った毛細管針をクランプマウントマイクロマニピュレーターに取り付け、磁気マウントで安定させます。2マイクロリットルの注射液を滅菌ペトリ皿にピペットで入れます。
顕微鏡で観察しながら、マイクロマニピュレーターに付属の空気圧シリンジを用いて、1〜2マイクロリットルの注入液をマイクロ注入針にゆっくりと取ります。針に気泡を取り込まないでください。6〜8週齢の雌マウスに麻酔をかけ、カルプロフェンを皮下投与した後、背側を上に向けて加熱した吸収紙の上にマウスを置きます。
手術中の乾燥を防ぐために、各目に目の潤滑剤を塗布します。鉗子で足指をつまんで麻酔停止を確認した後、切開部位の周囲を背側毛を取り除き、素肌を消毒液で拭きます。まっすぐで鈍い鉗子を使用して素肌をつまみ、滅菌ハサミを使用して体の正中線に沿って長さ1センチの切開を作成します。
滅菌Adson鉗子のペアを使用して、切断部位の片側をつまんで保持します。次に、一対の滅菌された湾曲した鋸歯状の鉗子を使用して、正中線切開から始めて横方向に移動して、皮膚を体壁から穏やかに分離します。脂肪パッドを腎臓の下に配置した後、滅菌済みのまっすぐな鈍い鉗子を使用して、脂肪パッドの真上の体壁をつまみます。
血管を避けるように注意しながら、一対の滅菌された、鋭く、先のとがった解剖ハサミを使用して、体壁に小さな切開を作成します。まっすぐで鈍い鉗子で体壁をつまんでいる間、一対の滅菌された、鈍い、湾曲した鉗子を切開部に挿入し、体壁に作られた切開部を広げます。鈍くて湾曲した鉗子で目に見える脂肪パッドをつかみ、穴から引き出して卵巣、卵管、子宮を露出させます。
滅菌ブルドッグクランプで脂肪パッドをクランプすることにより、生殖トラックを露出させたままにします。麻酔をかけたマウスを、生殖軌跡を解剖顕微鏡のステージに露出させて慎重に置きます。溶液の入った注射針が顕微鏡で観察されるようにマイクロマニピュレーターを調整します。
次に、顕微鏡を操作して、卵巣、卵管、子宮を簡単に観察します。一対の滅菌、テーパー、超極細先端鉗子を使用して、注入する卵管の領域を保持します。領域は、マイクロインジェクション針の方向と整列する必要があります。
マイクロマニピュレーターを調整して、マイクロインジェクション針で卵管を穿刺すると同時に、テーパー状の超極細先端鉗子を使用して卵管を針に送ります。マイクロインジェクションの針をそっと動かして、卵管に挿入されたことを確認します。青い溶液の動きと卵管内腔の拡張を観察しながら、1マイクロリットルの注射液と5%ろ過されたトリパンブルーを卵管にゆっくりと注入します。
内腔に気泡を入れないでください。注射後、卵管から針を外し、PBSに予め浸した吸収紙で標的とする領域を覆います。あらかじめ浸した紙とターゲットとする領域を電極ピンセットでつかみ、本体から引き離します。
30ボルトの3つのユニポーラパルスを使用して、1秒間隔で50ミリ秒間、ターゲット領域をエレクトロポレーションします。エレクトロポレーション後、吸収紙を取り除き、マウスを加熱パッドに戻します。ブルドッグクランプを外し、露出した生殖トラックを体壁の下に慎重に押し戻します。
両方の卵管をエレクトロポレーションして体壁の下に戻した後、ニードルホルダーを使用して針をつかみます。滅菌された湾曲した鋸歯状の鉗子を使用して、切断部位の片側をつまんで保持します。次に、ニードルホルダーを使用して縫合糸を操作し、傷を閉じます。
マウスを加熱パッドの上に置かれた清潔なケージに移動し、マウスがアクティブになるまで監視します。3mmまたは1mmのピンセット型電極を用いたエレクトロポレーションでは、TdTomatoで標識された標的領域は遠位卵管上皮に限定された。3ミリピンセット型電極では,1ミリピンセット型電極を用いて最遠位端の眼底のみをターゲットにする場合に比べて,膨大部の面積がはるかに広い。
標的領域では、TdTomatoによってマークされたエレクトロポレーション細胞は、非エレクトロポレーション細胞間でランダムに分布した。さらに、エレクトロポレーションされた細胞は粘膜上皮に限定され、下にある間質層または筋肉層では観察されなかった。CRISPRを介したゲノム編集を確認するために、DNA単離およびシーケンシングのためのFACSソーティングによって蛍光細胞を単離することができます。
これにより、標的対立遺伝子の頻度を定量化し、サンプル間の固有のコミュニケーションを追跡して、原発腫瘍のin vivo冠状進化と免疫適格環境での転移を追跡することができます。
